法洛四联症患儿Cx43基因序列分析及其表达和调控机制的研究

摘要

先天性心脏病(以下简称先心病)是常见的出生缺陷之一，在新生婴儿中发病率约6‰～9‰，是1岁以内婴儿死亡的主要原因。WHO资料显示，全球每年约有150万先心病患儿出生，其中，我国每年约有15万～20万先心病患儿出生。圆锥动脉干畸形是由于胚胎期圆锥动脉干发育异常所导致的一类紫绀型先心病，约占全部先心病的30％。而其中法洛四联症是最为常见的圆锥动脉干畸形之一，约占先心病的10％。法洛四联症患儿自然预后不佳，若未及时诊治则大多在成年期前死亡，即使手术纠治仍将存在一些残余问题而影响生活质量，给社会和家庭造成较大的经济和精神负担。因此，对其发病机制进行研究，对于开展产前咨询和预后预测等具有重要意义。
　　 作为哺乳动物心脏中最主要的间隙连接蛋白，动物实验已显示Connexin43(Cx43)可能是圆锥动脉干畸形遗传易感性的候选基因，但尚未在人类法洛四联症中得到证实。本研究通过检测法洛四联症患儿的Cx43基因编码区和启动子序列、右室流出道心肌组织中Cx43蛋白和mRNA的表达水平及其表达调控机制，探讨人类法洛四联症与候选易感基因Cx43的关系，以及Cx43基因究竟在哪些环节上参与法洛四联症发病机制。本研究不仅可部分阐明Cx43基因在人类法洛四联症发病机制中的作用，而且可为其他出生缺陷的研究提供可借鉴的研究思路和研究方法。
　　 第一部分法洛四联症患儿Cx43基因编码区和启动子区DNA序列分析
　　 目的：
　　 检测法洛四联症患儿Cx43基因的编码区和启动子区序列变化，分析其在法洛四联症发病中的作用。
　　 方法：
　　 应用PCR技术以及测序方法，对200例法洛四联症患儿、200例心脏结构正常的健康儿童，对Cx43基因编码区和其启动子区(上游5’-非编码区前2000bp左右)的碱基序列进行测序。对Cx43基因序列变化与法洛四联症的关系进行分析。
　　 结果：
　　 1.有2例患儿编码区分别存在1个突变位点，分别为c.G455A，c.G716A，均为杂合突变，但未引起氨基酸序列改变。
　　 2.在启动子区域发现病例组有4个突变位点，分别为T-153C、T-157C、T-266C和A-1462G，其中T-266C突变存在于2例患儿中，T-153C、T-157C和A-1462G突变分别存在于另3例患儿中。启动子区域还存在11个多态位点，其中4个多态位点(包括T-1032C、G-1415A、T-1478C、C-1569T)在dbSNP数据库中未查到，可能为中国人群特有的多态位点，其等位基因和基因型分布在病例组和对照组间无统计学差异(p>0.05)；另外7个多态位点分别为C-284T(rs9597379)、A-416C(rs2071166)、G-535A(rs2071165)、G-925C(rs1925223)、A-14086(rs75153918)、G-1431GA(rs73532207)、T-1958C(rs37631741)。其中-1431位点G、A等位基因的分布在两组间具有统计学差异(X2=0.698，p=0.034)，-1958位点TT/TC/CC基因型分布在两组间具有统计学差异(p=0.047)。通过生物信息学预测-1431位点下游65bp存在Nkx2-5结合位点。
　　 小结：
　　 1.法洛四联症患儿Cx43基因编码区突变少见
　　 2.法洛四联症患儿Cx43基因启动子区多个位点突变以及SNP改变可能影响了一些重要转录因子如Nkx2-5结合，从而成为其参与TOF发病的重要环节
　　 第二部分法洛四联症患儿右室流出道心肌组织Cx43基因的表达研究
　　 目的：
　　 检测法洛四联症患儿右室流出道心肌组织中Cx43基因mRNA和蛋白水平表达情况，探讨其表达异常在法洛四联症发病中的作用。
　　 方法：
　　 选取30例法洛四联症患儿右室流出道心肌组织作为研究对象，以10例与之年龄和性别相匹配的非心源性死亡儿童右室流出道心肌组织为对照，应用Real-time PCR和免疫组化的方法检测Cx43基因在法洛四联症患儿右室流出道心肌组织中的表达水平。
　　 结果：
　　 1.法洛四联症患儿右室流出道心肌组织中Cx43基因mRNA表达明显高于对照组(p=0.0006)。
　　 2.法洛四联症患儿右室流出道心肌组织中Cx43基因紊乱分布于细胞膜和胞浆，而规则分布于正常心肌组织细胞闰盘连接处；Cx43蛋白水平表达同样高于对照组。
　　 小结：
　　 法洛四联症患儿可能存在转录和翻译水平调控异常，导致Cx43 mRNA和蛋白水平表达均明显增高。Cx43异常分布和高表达可能影响了心脏发育过程中神经嵴细胞迁移以及一些重要信号通路和转录因子的信号传导，导致右室流出道梗阻等表型异常。
　　 第三部分 TOF患儿右室流出道心肌组织中Cx43基因表达调控机制的研究
　　 目的：
　　 检测法洛四联症患儿右室流出道心肌组织中Cx43基因启动子和增强子区甲基化水平、Cx43基因相关microRNAs表达水平以及相关转录因子表达水平，探讨法洛四联症患儿Cx43基因表达增高原因及其参与法洛四联症发病的环节。
　　 方法：
　　 选取30例法洛四联症患儿右室流出道心肌组织作为研究对象，以8例与之年龄和性别相匹配的非心源性死亡儿童右室流出道心肌组织为对照，应用MassARRAY高通量检测技术检测法洛四联症患儿右室流出道心肌组织中Cx43基因启动子和增强子甲基化水平，同时应用Luciferase报告基因验证有差异的甲基化位点的功能；应用Real-time PCR检测与Cx43基因相关的10个microRNAs表达水平，同时应用PCR和测序方法对Cx43基因3’UTR区microRNA结合位点进行序列分析；应用Real-time PCR检测Cx43基因相关转录因子表达水平。
　　 结果：
　　 1.法洛四联症患儿右室流出道心肌组织中Cx43基因启动子区甲基化水平与对照相比无统计学差异(p>0.05)；第一内含子内一段增强子区3个CpG点的甲基化水平明显低于对照组，差异有统计学意义(p=0.007)。体外实验证明将含有增强子区域的质粒转染HEK293T细胞，其Luciferase活性明显上调(3.36倍)；而将增强子进行体外甲基化处理后再次转染HEK293T细胞，其Luciferase活性明显下调(60％)。
　　 2.法洛四联症患儿右室流出道心肌组织中miR-1(p=0.0001)、miR-206(p=0.0112)表达明显低于对照组；而miR-130a、miR-19a、miR-30a、miR-30c、miR-30d和miR-130b表达与对照组相比无统计学差异(p>0.05)；miR-30e，miR-144在右室流出道心肌组织中不表达。对法洛四联症患儿Cx43基因3’UTR区miR-1/miR-206结合位点进行测序未发现突变和差异分布的多态位点。
　　 3.法洛四联症患儿右室流出道心肌组织中Cx43基因相关转录因子Nkx2-5、p53表达水平与对照相比无统计学差异。
　　 小结：
　　 1.法洛四联症患儿Cx43基因增强子区存在异常低甲基化，提示增强子区的低甲基化可能影响了某些转录因子结合，在转录水平导致其右室流出道心肌组织Cx43 mRNA水平异常高表达。
　　 2.法洛四联症患儿存在miR-1、miR-206表达降低，推测miR-1和miR-206可能作为一种重要的转录后调控方式，在转录后水平导致其右室流出道心肌组织中Cx43蛋白水平异常高表达。
　　 3.法洛四联症患儿Cx43基因表达增高可能与转录因子Nkx2-5、p53表达水平无关。