小胶质细胞抗原呈递功能的调控在大鼠视网膜光损伤模型中的作用研究

摘要

第一部分：SD大鼠光损模型的建立及观察
　　 本部分研究选用成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重180-210克(g)。所有实验大鼠均在12小时(h)明(30～50Lux)及12h暗(0～10Lux)循环光环境下适应7天(d)后，予以缝线开睑，1％阿托品扩瞳。经24h暗适应(0～10Lux)，放入光照箱中接受24h强度为2500Lux的宽谱蓝光(波长400～440nm)照射，温度控制在22～25摄氏度(℃)。光照结束后再次置于黑暗(0～10Lux)环境下适应24h，后恢复12h明以及12暗循环光环境。在光照后即刻(0h)、2h、6h、1天(d)、3d、7d、及14d时取大鼠视网膜切片，行苏木素-尹红(H-E)染色及TUNEL染色观察实验大鼠视网膜组织结构的改变及细胞凋亡的情况。
　　 结果显示：正常SD大鼠视网膜切片见各层层次清晰，由内向外依次可见3层界限分明的核层，由苏木素着染呈蓝紫色。最内层为神经节细胞核层(GCL)，由一至二层细胞核，较大，可见核仁，其内为视网膜神经纤维层(NFL)；中间层为内核层(INL)，多层细胞核，比GCL层小，排列较外核层(ONL)略稀疏；最外层为ONL，细胞层次最多且最密集，核小且深染。感光细胞内/外节(IS/OS层)层位于ONL之外，尹红着染呈红色，排列整齐，内/外节间见少量间隙。光照主要损伤外层视网膜，尤其是ONL和IS/OS层。光镜下观察，视网膜损伤性改变最早出现于光损伤后6h，见IS/OS肿胀，排列紊乱，此时ONL无明显改变；光损伤后1d，IS/OS层破坏，见ONL细胞核排列紊乱而厚度尚未变化；光损伤后3d，IS/OS层几乎消失，ONL细胞核显著减少，核质固缩，厚度明显变薄，提示光感受器大量丢失；光损伤后7天，ONL进一步变薄，细胞核丢失；光损伤后14d时ONL仅剩余一至二层细胞核，视网膜显著变薄。光照主要通过细胞凋亡的途径损伤ONL。正常大鼠视网膜切片呈TUNEL(-)；光损伤后2h，于ONL出现TUNEL(+)细胞，INL和GCL呈TUNEL(-)；光损伤后1d，ONL中TUNEL(+)细胞数量达到最高峰，阳性细胞核皱缩，染色质凝聚成致密的块状，多聚集于核膜下，呈现“新月形”及“环形”等染色质边集的典型细胞凋亡特征；光损伤后3d，ONL的TUNEL(+)细胞数量开始减少，伴随ONL细胞数量显著减少；光损伤后14d，ONL细胞几近消失，仅存一至二层，TUNEL(-)。由此可见，光照主要通过凋亡的方式损伤大鼠ONL，ONL细胞凋亡先于细胞数量的减少。
　　 第二部分：SD大鼠光损模型中小胶质细胞的活化、迁移及抗原呈递功能的变化
　　 光损伤后2h、6h、1d、3d、7d、14d，采用免疫荧光染色观察SD大鼠视网膜OX42(+)细胞(小胶质细胞)的形态和迁移；观察小胶质细胞主要组织相容性分子Ⅱ(MHC-H)及其上游分子CIITA的表达。
　　 结果显示：正常SD大鼠视网膜切片中可见少量OX42(+)细胞，主要位于NFL和内丛状层(IPL)内，细胞多突起，呈细分枝状，ONL或视网膜下均呈OX42(-)；光损伤后即刻，OX42(+)细胞开始出现在ONL，细胞形态多样，仍有突起，但较正常时突起减少，且更粗大；随后视网膜外层OX42(+)细胞迅速增加，随时间逐渐向外层移动；光损伤后3d，OX42(+)细胞数量达到最高峰，主要位于IS/OS层和视网膜下，细胞边界圆润光滑，呈阿米巴样外观，细胞突起显著减少。正常SD大鼠视网膜切片中MHC-Ⅱ(+)细胞很少，偶见位于NFL的单个MHC-Ⅱ(+)细胞；直至光损伤后3d，可于IS/OS层和视网膜下见部分MHC-Ⅱ(+)细胞；此后逐渐减少，至光损伤后7d，MHC-Ⅱ(+)细胞基本消失。作为MHC-Ⅱ的上游分子，CIITA具有相似的表达情况。
　　 第三部分：感光细胞间维生素A类结合蛋白(IRBP)R16多肽免疫治疗对光损伤模型中光感受器的保护作用
　　 本部分研究实验大鼠分为IRBP R16治疗组、PBS对照组和空白对照组。IRBP R16治疗组注射IRBP R16多肽进行免疫干预后建立光损伤模型，PBS对照组注射PBS后建立模型，而空白对照组不做任何处理，直接进行光照。
　　 结果显示：PBS对照组表现为光损伤后6h见视网膜IS/OS肿胀，但ONL细胞层次无明显改变；光损伤后1d，IS/OS破坏，ONL细胞核排列紊乱，但此时ONL厚度未见明显改变；光损伤后3d，IS/OS几乎消失，ONL层次显著减少；光损伤后7天，ONL细胞核数量进一步减少；至光损伤后14d时ONL仅剩余一至二层细胞核，视网膜显著变薄。这与空白对照组视网膜外层改变无明显区别。相比PBS对照组和空白对照组，IRBP R16治疗组光损伤3d后ONL厚度显著提高，此时的ONL厚度与光损伤后3d时无显著差别，提示IRBP R16多肽免疫治疗对光感受器的保护作用。另一方面，PBS对照组ONL细胞凋亡情况也与空白对照组一致，表现为光损伤后2h，ONL出现TUNEL(+)细胞；光损伤后1d，TUNEL(+)细胞数量达到最高峰，显示出典型凋亡改变；光损伤后3d，TUNEL(+)细胞数量减少，伴随ONL细胞数量减少；光损伤后14d，ONL细胞几近消失，仅存一至二层，此时TUNEL(+)细胞不能检出。而IRBP R16治疗组在光损伤后2h时ONL开始出现TUNEL(+)细胞，1d后TUNEL(+)细胞数量达到高峰，但其数量明显少于另两组，此后TUNEL(+)细胞逐渐减少，至光损伤后7d未见凋亡细胞，但可见ONL细胞数量显著多于另两组。
　　 第四部分：IRBP R16多肽免疫治疗上调SD大鼠视网膜小胶质细胞抗原呈递相关分子的表达
　　 三组大鼠光损伤后各时点采用免疫荧光染色比较不同组大鼠视网膜OX42(+)小胶质细胞活化和迁移；比较不同组间小胶质细胞主要组织相容性分子Ⅱ(MHC-Ⅱ分子)及其上游分子CIITA表达的差异；采用Western Blot方法定量比较不同组间视网膜小胶质细胞抗原呈递分子表达的差异。
　　 结果显示：PBS对照组表现为光损伤后即刻(Oh)，ONL开始出现OX42(+)细胞；之后OX42(+)细胞数量增加，并逐渐向外层移动；光损伤后3d，OX42(+)细胞数量达到最高峰，主要位于IS/OS层和视网膜下腔，细胞呈阿米巴样外观。这与IRBP R16治疗组和空白对照组视网膜内OX42(+)细胞各核层细胞的数量和位置变化无明显区别，提示足垫内注射IRBP R16+弗氏佐剂或PBS+弗氏佐剂均对光损伤时小胶质细胞的活化能力不产生影响。另一方面，PBS对照组在小胶质细胞抗原呈递分子MHC-Ⅱ和其上游分子CIITA的表达时间和表达量上与空白对照组没有区别，表现为光损伤后3d，可于IS/OS层和视网膜下见部分MHC-Ⅱ(+)和CIITA(+)细胞；此后逐渐减少，至光损伤后14d，MHC-Ⅱ(+)和CIITA(+)细胞基本消失。在IRBP R16对照组大鼠视网膜中，可见MHC-Ⅱ(+)细胞早在光损伤后1d即在视网膜外层大量出现，其数量和表达强度与光损伤后3d没有区别。Western Blot结果也证实，相比PBS对照组和空白对照组，IRBP R16治疗组视网膜MHC-Ⅱ和CIITA的表达升高更早，而且表达量更高，提示视网膜小胶质细胞抗原呈递功能增强。