基于人抗体可变区框架结构和拮抗肽设计新型TNF-α人源小分子拮抗剂

摘要

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种多功能的细胞因子，参与许多重要的生理功能，但TNF-α的过表达会破坏机体的免疫平衡，与类风湿性关节炎、Crohn’s病等多种疾病密切相关。基础和临床研究都证实，抑制TNF活性是治疗这类疾病的一个有效措施。目前，已被FDA批准的TNF-α拮抗剂有TNFRII-F<,C>融合蛋白和抗TNF-α单抗，但昂贵的生产成本或潜在的诱发人抗鼠抗体反应(HAMA)的副作用，使其广泛应用受到一定限制。开发新型TNF-α拮抗分子必要而有意义，人源小分子抗体由于其独特的治疗价值而受到人们的瞩目，但高亲和力人源抗体的获得有一定困难。 本实验室在TNF-α拮抗分子研究方面取得了一定进展：自主研制的鼠抗TNF-α中和单抗Z12能特异性识别TNF-α的141～146位这一功能表位；根据理论模拟构建的TNF/抗体相互作用的复合物模型，设计获得功能性拮抗肽(PT2、PT3、PT4、PT7)；利用人抗体可变区重链框架(V<,H>5)展示拮抗肽(PT2、PT3、PT4)，设计并合成获得单域抗体(PTVH5)，其活性明显好于拮抗肽，证明抗体可变区框架适于展示拮抗肽。 基于此，借助已建立的“基于抗原—抗体相互作用结构信息设计新型功能分子”的技术平台，本论文提出以人抗体可变区(重链、轻链)框架展示拮抗肽(PT2、PT3、PT4、PT7)设计虚拟单链抗体构象库，借助TNF/抗体相互作用动态模式，虚拟筛选新型TNF-α单链抗体分子，合成获得单链抗体分子并通过生物学实验验证其功能。 研究结果如下： 1．在单域抗体PTVH5(用V<,H>5框架来展示拮抗肽PT2、PT3、PT4)的基础上，按照“结构匹配、静电互补”的原则，从人的七类轻链可变区(V<,L>)通用框架中选择与之匹配的V<,κ>I框架，用拮抗肽PT7替换V<,κ>I框架中的CDR3区，通过Linker连接，设计成新型分子TSA1。理论分析发现，TSA1稳定性较好，识别TNF-α的14l～146功能位点(即Z12识别的位点)。生物学实验证明，TSA1能与TNF-α结合、抑制TNF-α与TNFR的结合、抑制TNF-α介导的细胞毒作用及NF-κB的激活，而且TSA1的活性比之前设计的单域抗体有显著提高(中和TNF-α介导的细胞毒实验中，单域抗体PTVH5的IC<,50>值为56.5+3.2μmol/L；TSAl的IC<,50>值为0.098±0.01 μmol/L)。但与S-Remicade(上市抗体Remicade的单链形式)相比，TSA1的活性较弱。 2．从框架的合理选择和拮抗肽的合理定位两方面来优化设计方案，设计虚拟单链抗体构象库，以期筛选得到活性更好的拮抗分子。TSA1与TNF的动态作用模式表明，在与TNF的结合过程中，重链CDR3(HCDR3，即拮抗肽PT4)起着关键的作用。鉴于此，根据4种拮抗肽活性的差异(PT7>PT4>PT2≈PT3)，将其中活性最好的PT7安排在HCDR3的位置，其余三个拮抗肽PT2、PT3、PT4在HCDR1、HCDR2、LCDR3的位置上随机组合。结合七类V<,H>和七类V<,L>框架产生的49种框架组合，利用计算机模建技术，设计人单链抗体构象库，虚拟筛选得到以V<,λ>I与V<,H>5为框架设计的新型单链抗体TSA2(拮抗肽PT2、PT3、PT7分别替换HCDR1、HCDR2、HCDR3，拮抗肽PT4替换LCDR3)。理论分析表明，TSA2在与TNF-α的相互作用区域、结合自由能、分子间氢键等方面均显著优于TSA1。生物学实验证明，与TSA1相比，TSA2的活性显著提高，与理论预测结果一致。而且TSA2的活性在一定程度上与S-Remicade(上市抗体Remicade的单链形式)相接近，达到预期效果。 本论文初步验证了“借助计算机模建，基于人抗体可变区的框架结构和拮抗肽，设计虚拟单链抗体构象库并从中筛选新型拮抗分子”的策略是可行的，从而为人源小分子抗体的制备提供了一条可供选择的途径。

目录

声明

摘要

引言

第一部分新型分子(TSA1)的计算机辅助设计与功能评价

一、新型分子(TSA1)的计算机辅助设计

1材料与方法

2结果

3讨论

二、新型分子(TSA1)的功能评价

1材料与方法

2.结果

3.讨论

小结

第二部分虚拟单链抗体构象库的建立及TSA2的筛选与功能评价

一、虚拟单链抗体构象库的建立及TSA2的筛选

1材料与方法

2结果

3讨论

二、新型分子(TSA2)的功能评价

1材料与方法

2.结果

3.讨论

小结

总结

参考文献

附录

致谢