多肽介导肝肿瘤靶向诊断与治疗的纳米载药系统

摘要

目前恶性肿瘤的发病率持续上升，肝肿瘤是我国常见恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤发病顺序中占第二位，每年新增病例超过30万。肝肿瘤具有恶性度高、病情发展快、生存期短等特点。肝肿瘤死亡率很高，平均5年生存期患者的比例仅为14.4％。肝肿瘤的诊断和治疗存在很多尚未解决的问题。早期肝肿瘤缺乏明显的症状，采用目前临床上常用造影剂，由于缺乏对肿瘤的特异性识别，很难在早期发现肝肿瘤。目前仍然只有早期小型肝肿瘤可手术切除治疗，晚期肝肿瘤手术困难且术后高复发。药物是肝肿瘤治疗中的重要手段，然而目前的抗肿瘤药物肿瘤靶向性差、治疗效果不佳、毒副作用大。迄今为止尚缺乏有效的治疗药物。
　　 靶向纳米药物技术在肿瘤的诊断和治疗中显示出独特的优势和良好的临床应用前景。本文的目的是通过构建多肽介导肝肿瘤靶向诊断与治疗的纳米载药系统来解决上述肝肿瘤诊断与治疗中存在的问题。
　　 肝肿瘤细胞活动旺盛、迅速分裂生长，因而形成了肿瘤组织、细胞不同于正常组织、细胞的病理变化：新生血管结构不完整，肿瘤血管渗透滞留增强(enhanced permeability and retention effect，EPR)[1-5]、无氧代谢、细胞转化、生长失控和跨膜pH调节能力增加形成的肿瘤细胞外弱酸环境[6-10]、营养物质大量需求形成的肿瘤细胞表面相关受体的表达上调[11-20]。这些与正常组织不同的病理特征，为靶向纳米递药系统的设计、应用提供了依据。
　　 本文针对肝肿瘤病理特征，(1)肿瘤血管渗透滞留增强，(2)肿瘤细胞外弱酸环境；(3)表达上调受体，设计三种肝肿瘤靶向递送的策略，并依次三种策略将全文分为三个部分共七章内容：
　　 第一部分结合EPR效应和肿瘤细胞外微酸环境的策略一
　　 基于EPR效应被动靶向的设计主要是将药物递送系统设计在纳米尺度，经血液循环被动靶向进入肿瘤组织，实现组织水平肿瘤靶向。
　　 而本文第一部分策略一是在纳米递送系统经EPR效应被动靶向进入肿瘤组织后，结合肿瘤细胞外微酸环境，实现从肿瘤组织向肿瘤细胞的靶向。而基于肿瘤细胞外微酸环境从肿瘤组织向肿瘤细胞的靶向则是来源于一种可在弱酸性条件下插入到细胞膜的多肽。
　　 pH敏感肽pH-Low-Insertion-Peptide(pHLIP)来源于细菌视紫红质的跨膜螺旋蛋白C，在弱酸性条件下(pH6-6.5)可插入细胞膜形成跨膜螺旋[21-24]。通过亲水性高分子聚乙二醇：Polyethylene glycol(PEG)利用pHLIP修饰树枝状高分子聚赖氨酸Dendrigraft Poly-L-lysines(DGL)，合成肿瘤细胞靶向载体DGL-PEG-pHLIP。利用DGL-PEG-pHLIP携载药物设计纳米载药系统可通过EPR效应和肿瘤细胞外微酸环境下pHLIP的插入细胞膜作用实现肿瘤组织到肿瘤细胞的两步靶向。本文第一章利用DGL-PEG-pHLIP携载pH敏感荧光探针(BF2-chelated tetraarylazadipyrromethenes)，制备pH敏感荧光探针纳米载药系统。本文全新合成的pHLIP修饰肿瘤细胞膜靶向pH敏感荧光探针纳米载药系统分别基于pH智能控制的电子转移和酚羟基/酚盐转变两种机理发射荧光，在正常组织中性pH下电子的共轭转移无荧光，酸性条件下分子内电子的共轭体系破坏从而开启分子的近红外荧光。pH敏感荧光探针荧光强度随pH降低增强，pH6.0时荧光强度是pH7.4时的8倍。此外，该纳米载药系统具有水溶性和肝肿瘤细胞膜靶向性。本文第二章利用DGL-PEG-pHLIP制备了肝肿瘤靶向载基因纳米载药系统(Nanoparticles，NP)。血管内皮细胞生长因子Vascular Endothelial GrowthFactor(VEGF)是促进肿瘤新生血管形成的重要因子[25]。小分子RNA干扰技术下调VEGF可有效抑制肿瘤新生血管形成[26，27]。DGL-PEG-pHLIP复合VEGF沉默质粒(small hairpin RNA against VEGF，shVEGF)制备了肝肿瘤靶向载基因纳米载药系统pHLIP-NP/shVEGF。pHLIP-NP/shVEGF具有良好的肿瘤靶向效率，肝肿瘤部位的浓集效率是未修饰纳米载药系统NP/shVEGF的4倍，具有高效的VEGF沉默效果，能够有效抑制肝肿瘤新生血管的生成，从而显著抑制肿瘤生长。
　　 第二部分结合EPR效应和肿瘤细胞高表达受体介导的主动靶向的策略二
　　 如策略一所述，EPR效应被动仅能实现组织水平肿瘤靶向，除了肿瘤细胞外微酸环境，肿瘤细胞表面过度表达的受体可被用来作为靶点，通过在纳米系统上修饰可以特异性结合这些受体的配体，可实现从肿瘤组织向肿瘤细胞的靶向。而这需要受体的选择和靶向头基的引用。
　　 转铁蛋白(transferrin，Tf)受体(transferrin receptor，TfR)在肝肿瘤细胞表面表现为高表达[12，28]。目前，Tf被作为肿瘤靶向头基广泛应用于肿瘤靶向纳米载药系统的设计。但是内源性高浓度Tf可能影响Tf修饰纳米载药系统的肿瘤靶向效率；而且Tf本身分子量大(80 kDa)，其化学修饰存在一定的难度。本文第三章基于Tf作为靶向头基介导肿瘤靶向递送存在的局限性，考察通过噬菌体展示技术筛选出可特异性结合人TfR并内吞入胞的分别含7和12个氨基酸的T7肽(HAIYPRH)和T12肽(THRPPMWSPVWP)作为靶向头基的可能性[29]。
　　 评价树枝状高分子(polyamidoamine dendrimers，PAMAM)通过PEG修饰上述潜在靶向头基制备的载体(PAMAM-PEG-T7、PAMAM-PEG-T12、PAMAM-PEG-Tf)在高表达TfR肿瘤细胞上的摄取。在血浆高浓度Tf存在时PAMAM-PEG-Tf的摄取相比无Tf存在时明显降低；而PAMAM-PEG-T7与无内源性Tf存在时摄取更加显著，这证明了TfR上与T7的结合位点和与Tf的结合位点不同[30]。T7有可能解决Tf作为靶向头基介导肿瘤靶向递送存在的局限性。本文基于策略二的部分选用T7作为肿瘤靶向头基。
　　 本文第四章以PAMAM-PEG-T7共价连接二乙基三胺五乙酸(Diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)，螯合Gd3+，形成肝肿瘤靶向磁共振造影剂纳米载药系统GdDTPA-PAMAM-PEG-T7。PAMAM-PEG-T7在肝肿瘤细胞上的摄取显著高于PAMAM-PEG。GdDTPA-PAMAM-PEG-T7的弛豫率是市售钆喷酸葡胺(GdDTPA)的2.2倍。GdDTPA-PAMAM-PEG-T7对裸鼠皮下肝肿瘤增强效果是GdDTPA-PAMAM-PEG的2.9倍，GdDTPA的4.1倍。GdDTPA-PAMAM-PEG-T7能够高效特异性靶向肝肿瘤、并延长显像时间。
　　 PAMAM内部含有大量疏水空腔，可包载疏水性药物[31-35]。本文第五章以PAMAM-PEG-T7包载疏水性抗肿瘤药物阿霉素(Doxombicm，DOX)，形成肝肿瘤靶向DOX纳米载药系统PAMAM-PEG-T7/DOX。PAMAM-PEG-T7/DOX粒径大约在10 nm。基于PAMAM的空间构象随着pH从中性至酸性呈现敏感变化[36]，PAMAM-PEG-T7/DOX中DOX在微酸环境中快速释放，而在中性条件下基本稳定。PAMAM-PEG-T7/DOX显著增加了肝肿瘤细胞对DOX的摄取。内源性Tf的存在显著降低PAMAM-PEG-T7/DOX对肝肿瘤细胞的IC50。PAMAM-PEG-T7/DOX在皮下肝肿瘤部位的浓集效率是PAMAM-PEG/DOX的1.7倍，游离DOX的5.3倍，显示出良好的肿瘤生长抑制效果。
　　 利用DOX可插入到基因双链中形成稳定复合物的特性[37，38]，本文尝试了基因药物和DOX的联合给药。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL)是介导细胞凋亡的信号分子，能够特异性与肿瘤细胞表面受体结合诱导凋亡，但不杀伤正常细胞[39，40]；同时DOX可显著提高TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的效率[4]。本文第六章采用TRAIL蛋白编码质粒(anexpression vector containing TRAIL open reading frame，pORF-hTRAIL)作为基因药物，将DOX插入到pORF-hTRAIL，形成pORF-hTRAIL-DOX复合物，以PAMAM-PEG-T7通过静电作用复合pORF-hTRAIL-DOX复合物，形成肝肿瘤靶向载TRAIL基因DOX纳米载药系统PAMAM-PEG-T7/pORF-hTRAIL-DOX，多靶点不同机制联合治疗肝肿瘤。每个pORF-hTRAIL分子可以携载约375个DOX分子。PAMAM-PEG-T7/pORF-hTRAIL-DOX相比未修饰组在肝肿瘤细胞上的摄取、基因药物表达和诱导细胞凋亡效果更为显著。同时，DOX的给药剂量降低约30倍，可达到比临床剂量DOX更好的肿瘤生长抑制效率。
　　 第三部分结合EPR效应、肿瘤细胞外微酸环境和主动靶向的策略三
　　 TfR不仅在肿瘤细胞表面高度表达[42-44]，在正常组织细胞如肝细胞、脾细胞、肺细胞、肾细胞等的表面都有表达，甚至在脑细胞表面也有表达[45]。因此，在利用T7介导增加药物肿瘤细胞靶向浓集的同时，可能导致正常细胞的药物蓄积，引发不必要的毒副作用。综合考虑肿瘤组织和正常组织的病理、生理差异，本文第七章设计了基于EPR效应、肿瘤细胞外微酸环境响应和主动靶向相结合的，肿瘤细胞外微酸环境控制开启的主动靶向纳米载药系统。采用亲水、负电的DTPA分子通过腙键改装T7肽末端，合成DTPA改装载体(DGt-PEG-T7-hydrazone-DTPA，DPThD)。在正常组织，T7肽被DTPA所隐蔽，不能被TfR识别、结合并介导入胞。而在肿瘤组织，肿瘤微酸环境下腙键断裂水解，T7肽显露出来并特异性识别结合。YfR介导入胞。此外，DTPA的亲水性，还可以大大降低补体系统的识别，延长纳米载药系统在血液中的循环时间。钙粘蛋白(Cadherin17，CDH17)与肝肿瘤转移息息相关[46]。CDH17沉默质粒(small hairpin RNA against CDH17，shCDH17)作为基因药物，将DOX插入shCDH17中形成shCDH17-DOX复合物，利用DPThD复合shCDH17-DOX，形成肝肿瘤靶向双载药纳米递释系统DPThD/shCDH17-DOX，高效浓集于肿瘤细胞的同时减少外周组织细胞的分布。