年龄相关性白内障晶状体蛋白磷酸化位点鉴定

摘要

白内障是全球首位致盲眼病，而年龄相关性白内障(age related cataract，ARC)也是老年人视力下降的主要原因。目前手术仍是治疗白内障唯一有效的方法，由于我国人口数量庞大，经济欠发达，高昂的手术费用会给社会带来沉重的经济负担。因此，预防或者推迟ARC发病，无疑具有重要意义。
　　 磷酸化是一种常见蛋白质翻译后修饰，磷酸化与去磷酸化这一可逆的过程调节着信号传导、基因表达等多种细胞生物学进程，而蛋白质磷酸化修饰的异常会引发一系列疾病。晶状体蛋白是人晶状体内含量最高的结构与功能蛋白，研究者推测晶状体蛋白的磷酸化与去磷酸化的过程失调可能是ARC发病的早期改变或者说是晶状体蛋白变性前的病变。
　　 由于晶状体蛋白磷酸化过程是可逆的，因此在晶状体蛋白尚未发生变性的早期，也即白内障形成之前是干预ARC发病的有效时机。鉴定晶状体蛋白的磷酸化位点，将是进一步探索位点功能的第一步。
　　 本实验首次利用原位酶解联合基质辅助激光解析电离质谱鉴定人透明晶状体与ARC晶状体组织切片中的磷酸化位点。研究者在人透明晶状体中鉴定到了4种晶状体蛋白中的8个磷酸化位点；在ARC晶状体中鉴定到了6种晶状体蛋白中的11个磷酸化位点，其中9个磷酸化位点先前未有报道。
　　 本实验为进一步的磷酸化位点质谱成像定位和磷酸化位点的功能学研究奠定了基础。
　　 第一部分
　　 晶状体冰冻切片及质谱鉴定条件的优化
　　 目的：探求人晶状体组织冰冻切片的最佳条件并优化基质辅助激光解析电离质谱对晶状体组织切片鉴定的实验参数。
　　 方法：(1)将-80℃冻存的人透明晶状体与ARC晶状体分别在-10℃至-25℃温度下沿赤道部轴向切片，切片厚度10μm至20μm，用解剖镜观察所得切片，确定最适宜的温度与切片厚度。
　　 (2)使用标准蛋白细胞色素C与马心肌红蛋白作为标准蛋白，从基质种类、基质喷涂层数、喷涂速度等各方面优化并探寻最佳的基质辅助激光解析电离质谱鉴定晶状体组织切片中磷酸化位点的实验参数。
　　 结果：经过解剖镜观察，最适宜的切片温度为-18℃，切片厚度为14μm。此条件下切片完整性好，易于转移和进一步的质谱鉴定。基质辅助激光解析电离质谱鉴定人晶状体组织切片的最佳实验条件为：以加入0.1％三氟乙酸、0.6-0.8mg/ml柠檬酸氨的浓度为2.5mg/mL的α-氰基-4-羟基-肉桂酸(50％乙腈：50％水)为基质，直接喷涂在组织切片表面；加热温度120℃，基质流速0.100ml/min，喷头移动速度200mm/min，晾干后进行质谱检测。所得质谱数据使用DataExPlorer4.5进行后期处理。
　　 结论：确立了人晶状体组织冰冻切片的最佳条件，并优化了基质辅助激光解析电离质谱对人晶状体组织切片鉴定的实验条件与实验参数，为进一步的研究奠定了基础。
　　 第二部分
　　 原位酶解结合基质辅助激光解吸电离质谱鉴定晶状体蛋白磷酸化位点
　　 目的：在优化了的实验条件下，利用原位酶解联合基质辅助激光解析电离质谱鉴定年龄相关性白内障晶状体及人透明晶状体中晶状体蛋白的磷酸化位点并比较其差异。
　　 方法：(1)将-80℃冻存的人透明晶状体与年龄相关性白内障晶状体在-18℃温度下沿赤道部轴向切片，切片厚度14μm，随后将组织切片转移至盖玻片上。
　　 (2)用肌红蛋白、牛血清白蛋和α-酪蛋白作为标准蛋白对胰蛋白酶-石墨烯固定化酶反应器的酶解效率进行考察。
　　 (3)利用胰蛋白酶-石墨烯固定化酶反应器联合基质辅助激光解析电离质谱鉴定人透明晶状体与年龄相关性白内障晶状体组织切片中的磷酸化位点，所得质谱数据使用DataExPlorer4.5进行后期处理。
　　 结果：研究者在人透明晶状体中鉴定到了4种晶状体蛋白中的8个磷酸化位点；在年龄相关性白内障晶状体中鉴定到了6种晶状体蛋白中的11个磷酸化位点，其中9个磷酸化位点先前未有报道。
　　 结论：首次利用原位酶解联合基质辅助激光解析电离质谱在年龄相关性白内障晶状体中鉴定到了6种晶状体蛋白中的11个磷酸化位点，为进一步的质谱成像定位和磷酸化位点的功能性研究奠定了基础。