针对PRRSV Nsp10的干扰研究和N蛋白磷酸化位点的鉴定

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,PRRSV）引起的一种猪的传染病。该病于 1987 年在美国首次报道，而后在世界各地均有发现该病。 1996 年，我国首次报道了 PRRSV。2006 年，在我国出现了能导致猪高热、高死亡率为主要特征的高致病性 PRRSV，给我国的养猪业带来了巨大的损失。在2014年，研究人员发现是Nsp9蛋白和Nsp10蛋白的联合作用导致了病毒毒力的提高。因此，对Nsp9基因和Nsp10基因进行遗传进化分析将有助于阐明其导致病毒毒力提高的具体机制。　　本研究首先从NCBI（National Centerof Biotechnology Information）上收集94条序列，对它们的 Nsp9 基因和 Nsp10 基因进行生物学分析。结果发现，Nsp9 基因同源性最低为 86.0%，氨基酸同源性为最低值 94.4%，Nsp10基因同源最低值为 84.2%，氨基酸同源性最低值 93.0%。对比 GP5 蛋白的分析结果，发现这两个基因都更保守。通过SNAP分析，发现Nsp9蛋白的C端和Nsp10蛋白的C端与Nsp10蛋白的N端处于正压力选择之下。同时通过比较蛋白的氨基酸序列，筛选出 5 个可能与病毒毒力有关位点，包括Nsp9蛋白的第384、519、544位点和Nsp10蛋白的第408和410位点。为进一步研究Nsp9蛋白和Nsp10蛋白的功能研究提供了理论基础。　　研究还参照 PRRSV的 Nsp10基因序列和 siRNA的设计原则，设计了 3条针对PRRSV Nsp10基因的siRNA，将其分别命名为siRNA-Nsp10-696、siRNA-Nsp10-875和siRNA-Nsp10-1095，并构建出了3个干扰质粒。将干扰质粒转染到Marc-145细胞后，再用 PRRSV感染细胞。通过间接免疫荧光实验发现，与阳性对照相比，这三条siRNA均可以有效抑制 PRRSV造成的细胞病变。Western-boltting和生长曲线结果也表明这 3 条 siRNA 可以有效抑制病毒复制和蛋白表达。qPCR 结果表明，siRNA-Nsp10-696，siRNA-Nsp10-875和siRNA-Nsp10-1095对PRRSV在Marc-145上的抑制效率分别为 99.24%，99.90% 和 99.25%。以上结果表明这三条 siRNA都可以有效抑制 PRRSV在 Marc-145上的复制。同时也表明 Nsp10蛋白是一个很好的潜在药物靶点，为抗病毒药物的研发奠定了基础。　　N蛋白作为病毒中含量最丰富的蛋白，可以与 PRRSV的 Nsp9蛋白、Nsp10蛋白和病毒 RNA发生相互作用。然而作为一个磷酸化蛋白，其磷酸化修饰对于蛋白的功能的影响尚未明确，并且 N蛋白磷酸化位点也没有得到鉴定。为了研究 N蛋白磷酸化修饰是否能对病毒的复制或 N 蛋白功能产生影响，本研究首先通过杆状病毒表达系统，成功表达出重组 N蛋白，并通过离子交换层析和镍柱层析将重组 N蛋白从裂解液中分离纯化。通过分析LC-MS/MS（liquid chromatography tandem mass spectrometry）质谱检测的结果，发现 N蛋白的 105位点和 120位点的丝氨酸上存在有磷酸化修饰。通过反向遗传技术，我们将 105 和 120 位点的丝氨酸突变成丙氨酸，把拯救出的病毒分别命名为 A105、A120 和 A105-120。通过间接免疫荧光实验，发现突变不会影响病毒的拯救和感染 Marc-145 细胞的能力。通过生长曲线实验，发现突变会导致病毒滴度在感染后的第 48 小时出现明显下降。表明突变影响了病毒的复制。荧光定量 PCR 实验结果与生长曲线结果相似，与亲本毒相比，突变毒株在感染后的第 48 小时，Nsp9 和 N 基因的 mRNA 水平显著降低，说明突变能影响病毒的mRNA的转录。但是 Western-blotting的结果表明，突变不影响 N蛋白的的表达水平。这表明磷酸化修饰可能是通过影响N蛋白的某些功能从而影响了病毒的复制能力。　　为进一步明确磷酸化修饰是否会影响 N 蛋白功能，我们构建出了 pCA-XH-GD、pCA-A105、pCA-A120和 pCA-A105-120四个真核表达质粒，将质粒转染到 BHK-21细胞中。激光共聚焦实验的结果显示，突变后的 N 蛋白在细胞内的分布与未突变的N 蛋白相同，用拯救出的病毒感染细胞也显示同样的结果。这表明磷酸化修饰不会影响N蛋白在细胞内的分布。之前的研究表明，N蛋白有调节IL-10的能力，我们用将4个真核表达质粒分别转入PAMs细胞中。通过qPCR检测，发现突变了105位点和120位点后的N蛋白，对于IL-10 mRNA的能力明显低于pCA-XH-GD。结果表明，磷酸化修饰能影响N蛋白对IL-10 mRNA的调节能力。是否因为突变导致蛋白对IL-10 的调节能力下降进而影响病毒的复制能力，还是因为其他原因导致的还需要更多的研究。　　综上所述，我们设计了3条能有效抑制PRRSV复制的siRNA。还发现了一个新的 N蛋白磷酸化位点，同时证明磷酸化修饰能影响病毒的复制，也能够影响 N蛋白对IL-10 mRNA的调节能力。本研究将有助于进一步了解PRRSV的复制机制，也为研究N蛋白磷酸化修饰的功能奠定基础。

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