人类肝脏组织中miRNa-660、miRNA-27b与CYP3A4表达的相关性研究

摘要

CYP3A4是人类最重要的Ⅰ相药物代谢酶，约占成人肝脏中药物代谢酶的60％，参与半数以上临床用药的体内代谢过程，且CYP3A4的酶活性决定其靶药物的体内代谢速率。CYP3A4的表达受到环境和遗传因素的共同影响，但CYP3A4酶活性个体差异的90％来源于遗传因素，现有基因变异的研究结果不能充分解释CYP3A4的个体化差异。miRNA作为基因转录后的重要调控因子，有研究从细胞水平证实了miRNA-27b能直接作用于CYP3A4的3'-UTR，下调CYP3A4的表达，但关于miRNA-27b是否在人类肝脏中调控CYP3A4的表达未做出确切解答，其他的miRNA在CYP3A4表达调控中的作用还知之甚少。
　　研究目的
　　筛查可能调控CYP3A4基因表达的miRNA，及其在人类肝脏组织中对CYP3A4的mRNA、蛋白水平和酶活性的影响;探讨miRNA-27b是否在人类肝脏组织中调控CYP3A4表达水平。
　　方法和结果
　　(1)采用三种软件预测可能作用于CYP3A4基因3'-UTR的miRNA，共预测出108种miRNA。
　　(2)通过高通量转染实验和荧光色素酶报告实验从108种miRNA中筛选出阳性miRNA12种。并从中选择了miRNA-660做进一步的功能验证，miRNA-660可明显抑制萤光素酶活性，使其降低35％。
　　(3)收集到28例人类肝脏组织，通过LNA标记的miRNA特异引物及SYBRGreen实时荧光定量PCR，检测miRNA-660和miRNA-27b在肝脏组织中的表达量，结果显示两种miRNA的表达水平在28个样本中存在明显差异。
　　(4)SYBR Green实时荧光定量PCR检测肝脏组织中CYP3A4的mRNA量，western blot检测CYP3A4蛋白量，HPLC检测CYP3A4酶活性，将三种表达水平与miRNA-660、miR-27b的表达值进行相关性分析，结果显示miRNA-660与肝脏组织中CYP3A4的蛋白、酶活性显著负相关(p＜0.05)，与mRNA无显著相关性(p＞0.05);miRNA-27b与肝脏组织中CYP3A4的mRNA、蛋白水平、酶活性均无显著相关性(p＞0.05)。
　　结论
　　(1) miRNA-660可能参与了人类肝脏组织中CYP3A4基因的表达调控，机制可能与抑制CYP3A4基因mRNA的翻译有关;
　　(2) miRNA-27b和人肝脏组织CYP3A4的表达水平没有明显相关性。

目录

英文缩写

摘要

前言

1．细胞色素酶系P450简介

2．CYP3A亚家族简介

3．CYP3A4的功能和重要性

4．CYP3A4基因的表达调控

材料和方法

1 材料与试剂

2 实验仪器

3 实验方法

3．1 软件预测作用于CYP3A4基因3’-UTR的miRNA

3．2 构建miRNA表达载体pll3．7和荧光素酶报告基因表达载体psiCHECK-Ⅱ

3．3 细胞培养

3．4 脂质体介导质粒转染细胞

3．5 双荧光素酶活性检测

3．6 Trizol法抽提肝脏组织总RNA

3．7 反转录mRNA

3．8 CYP3A4的mRNA实时荧光定量PCR

3．9 miRNA的实时荧光定量PCR

3．10 肝脏组织的总蛋白抽提和浓度测定

3．11 Western Blot

3．12 钙沉淀法抽提肝脏组织微粒体

3．13 高效液相色谱HPLC测定CYP3A4酶活性

3．14 数据分析

结果

1 软件预测作用于CYP3A4基因3’-UTR的miRNA

2 高通量双萤光素酶报告实验筛选miRNA

3 miRNA-660的双荧光素酶报告验证实验

4 miRNA-660和miRNA-27b在肝脏组织中表达量检测

5 肝脏组织中CYP3A4 mRNA水平及与miRNA-660、miRNA-27b相关性分析

6 肝脏组织中CYP3A4蛋白水平及与miRNA-660、miRNA-27b相关性分析

7 肝脏组织中CYP3A4酶活性及与miRNA-660、miRNA-27b相关性分析

讨论

参考文献

致谢

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