寄生植物肉苁蓉的叶绿体基因组序列测定及进化分析

摘要

大多数绿色植物的叶绿体基因组都包含约110个基因，但部分植物的叶绿体却发生了基因丢失现象，尤其是一些寄生植物丢失了大量的与光合作用作用相关的基因。列当科肉苁蓉（Cistanche deserticola）是一种全寄生沙漠植物，寄生于藜科梭梭(Haloxylon.ammodendron)的根部，吸收梭梭根部分泌的营养物质和水分。本文测定了寄生植物肉苁蓉的叶绿体全基因组DNA序列，其叶绿体全基因组为102，657bp，具有叶绿体基因组典型的四区结构:一个大单拷贝区(LSC，49，130bp)，一个小单拷贝区(SSC，8，819 bp)和两个反向重复区(IR，分别为22，354bp)。该基因组编码61个基因，包括30个tRNA基因和4个rRNA基因:16S、23S、4.5S和5S。虽然肉苁蓉完整的保留了所有的tRNA和rRNA基因，但还有25个基因发生了基因丢失，并且有30个基因变成了假基因。发生变异的基因大多是光合作用相关基因，如ATP酶复合物相关基因ΨatpF、细胞色素b/f复合物(pet)ΨpetG、光合系统Ⅰ(psa)ΨpsaA、光合系统Ⅱ(psb)psbH和光呼吸基因（ndh）ndhA等，唯一例外的是肉苁蓉保留了完整的psbM基因。在RNA聚合酶基因中(rpo)，ΨrpoA，ΨrpoB和ΨrpoC2变成假基因，rpoC1基因丢失。
　　本文将肉苁蓉叶绿体基因组DNA序列与已报道的列当科寄生植物Epifagusvirginiana和兰科寄生植物地下兰（Rhizanthella gardneri）在基因含量、GC含量和tRNA基因组成等方面进行了比较。三者间叶绿体基因组大小和基因含量存在以下关系:肉苁蓉(102，657bp＞ E.virginiana(70，028bp)＞地下兰(59，190bp)。总体而言，与E.virginiana及地下兰相比，肉苁蓉拥有更多的基因，但肉苁蓉缺少了accD和ycf1基因。肉苁蓉基因组的LSC区GC含量为16，110bp; SSC区GC含量为2，423bp;单个IR区GC含量为9，613bp。肉苁蓉保留了全部30个tRNA基因，而E.virginiana和地下兰分别只保留了17个和9个tRNA基因。说明肉苁蓉的全叶绿体基因组相对保守。
　　在此之前，列当科中也有基因水平转移的相关报道。但是，关于列当科植物和其寄主间的基因水平转移研究还未见报道。本文发现petB和rpoC2基因在肉苁蓉和其寄主梭梭之间存在基因水平转移。其中，在肉苁蓉叶绿体全基因组的研究中发现，petB基因已经完全丢失，而rpoC2基因保留了482bp。通过PCR和克隆发现在肉苁蓉总DNA中保留有petB基因和一个较长拷贝的rpoC2基因，BLAST结果表明，它们同梭梭同源性最高。因此，可以推测梭梭的这两个基因可能转移到肉苁蓉的细胞核或线粒体中。最后，应用贝叶斯法、最大简约法和邻接法对以上两个基因构建进化树，进一步讨论了肉苁蓉的基因水平转移现象。
　　本文在之前列当科系统发育研究的基础上，新加入了肉苁蓉属的分子数据，用最大似然法和贝叶斯法探讨肉苁蓉属的系统位置。基于rps16基因序列及rps16+ITS联合序列所构建的列当科系统发育树得出的结论一致:肉苁蓉属和列当属的亲缘关系最近，且肉苁蓉属、列当属（Orobanche）和草苁蓉属（Boschniakia）聚在同一进化枝内。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 叶绿体基因组及其研究进展

1．2 叶绿体基因组的基本结构

1．3 叶绿体基因组的基因组成

1．4 叶绿体基因组的测序

1．5 叶绿体基因组的注释

1．6 基因水平转移

1．7 系统发育分析

1．8 列当科植物的叶绿体基因组研究的现状

1．9 本研究的目的、立项依据及研究意义

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 提取肉苁蓉总DNA

2．3 肉苁蓉叶绿体基因组PCR扩增及序列测定

2．3．1 引物设计及PCR反应

2．3．2 胶回收

2．3．3 连接反应

2．4 肉苁蓉叶绿体基因组拼接及注释

2．5 GC含量分析

2．6 基因水平转移

2．7 系统发育分析

第三章 结果与分析

3．1 肉苁蓉叶绿体基因组的特点

3．1．1 肉苁蓉叶绿体基因组的组成

3．1．2 GC含量

3．1．3 tRNA基因的比较

3．2 基因水平转移现象的发现

3．2．1 基于petB序列建树

3．2．2 基于较长拷贝rpoC2序列建树

3．2．3 基于较短rpoC2序列建树

3．3 系统发育分析

3．3．1 基于rps16基因的系统发育树

3．3．2 基于rps16+ITS基因的系统发育树

第四章 讨论

4．1 肉苁蓉和其他寄生植物叶绿体基因组的差异

4．2 基因水平转移

4．3 系统发育分析

第五章 结论和展望

参考文献

致谢

硕士在读期间发表的论文

硕士在读期间参加的科研项目

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