山茶属植物个体内rDNA多态性及杜鹃红山茶的空间遗传结构

摘要

本论文包括两个不同的工作:第一是研究山茶属（Camellia L.）植物个体内的rDNA多态性，第二是研究杜鹃红山茶(C.changiiC.X.Ye)这一高度濒危物种的遗传多样性。具体研究内容包括:香港红山茶（C.hongkongensis Seemann）个体内rDNA的ITS序列的多态性，山茶属植物26S rDNA个体内及属内的多态性以及杜鹃红山茶的遗传多样性和空间遗传结构。
　　1) PCR扩增、克隆并测序香港红山茶的ITS片段，共获得74条序列，分析发现，在香港红山茶的基因组内存在极高的多态性，76％的序列是假基因，大量假基因的存在是其ITS多态性的一个重要原因，但功能基因也存在高度多态性。系统发育分析表明存在多种独立起源的假基因，但一半以上的假基因来自一次起源，这一类假基因拥有最长的进化历史，并发生多次倍增(duplication)至少分化出5类假基因，其中的4类假基因都分别有5-9条高度相似的序列，且每种类型的RNA都有相对稳定的二级结构，表明这些假基因很可能近期都发生了快速的基因倍增事件。此外使用其中一类假基因作为分子标记，成功的进行了物种鉴定，这提示，当功能基因太保守，不能区分不同物种的时候，这样的ITS假基因序列可能是一个物种鉴定的有用标记。香港红山茶ITS序列的高度多态性表明利用ITS序列构建山茶属物种的系统发育树，可能会严重影响我们了解山茶属物种间的真实关系。
　　2)从山茶属中挑选了分属于不同组的10个有代表性的物种，从山茶科4个属（Tuteheria，Stewatia，Schima，Ternstroemia）内选择4个物种做为外类群，利用PCR扩增其26S rDNA片段，克隆并测序，最后共获得552条26S rDNA片段的序列。结果发现在26S rDNA中同样存在极高的多态性和大量的假基因，所有山茶属物种假基因比例都为100％，外类群中与山茶属最近的物种Tutcheriahirta假基因也为100％，其他物种假基因比例较低(0，36％，44％)，说明山茶属植物的rDNA序列确实普遍存在较高的多态性。然而对C.sinensis基因组酶切后直接克隆获得的rDNA片段几乎都来自功能基因，这表明茶基因组中rDNA功能基因的丰度远大于假基因，经PCR扩增获得的获得大量假基因可能是由于PCR引物的偏转所致。对所有山茶属植物及外来类群的26S rDNA系统发育分析显示，山茶属的每一个种都存在多种类型的假基因，这些假基因很可能是很多次起源的，许多假基因很可能存在很长的时间，其起源时间至少在众多山茶属植物分化之前就已存在，有的甚至能追溯到山茶科的起源时间。在检测的13山茶属物种的假基因中，都发现近期假基因快速倍增的事件，说明这种假基因快速扩张事件在山茶中非常普遍，这暗示这些假基因可能在行使某种功能。研究还发现尽管匹克茶（C.piquetiana）也存在多种类型的假基因，但与山茶属的其它假基因不同，前者没有任何基因与其它种的假基因构成稳定的分枝，这与外类群石笔木（Tutcheria hirta）的假基因相似，这一结果表明匹克茶要么是山茶属的一个古老种，要么就是独立的属。
　　3)杜鹃红山茶是我国的特有种珍稀濒危种，整个物种只有一个种群，约1000株，分布于广东阳春，对这个唯一自然种群的绝大部分个体(697)进行定位及生态学调查，并用9对SSR引物研究该物种的遗传多样性和空间遗传结构。结果显示，该物种具有较高的遗传多样性和频繁的基因流，河流和水坝的阻隔均未使亚种群间形成显著分化，这可能与杜鹃红山茶较长的花粉传播距离（800米）有关。STRUCTURE显示该种群有两种基因来源，PCA分析将该种群分为两个类群，但并不与空间分布相对应，且两种类型间分化并不大，可能是由于较强的基因流的作用。空间自相关结果表明，杜鹃红山茶存在显著的空间结构，这可能与其种子的限制性散布有关。本研究的结果表明，水坝对杜鹃红山茶基因流的阻隔作用并不明显，但是会在一定程度上限制种子流的传播。此外，杜鹃红山茶的有效种群大小估算在176，这提示在对杜鹃红山茶进行保护时，数目不能少于176，否则可能会带来严重的近交衰退。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 山茶属植物个体内rDNA的多态性研究

1．1．1 山茶属植物简介

1．1．2 rRNA基因家族的结构与功能

1．1．3 rDNA基因家族的进化

1．1．4 rDNA在植物系统发育重建中的应用

1．1．5 山茶属植物ITS序列的研究进展

1．2 杜鹃红山茶的遗传结构

1．2．1 杜鹃红山茶简介

1．2．2 基因流与空间遗传结构

1．2．3 杜鹃红山茶及山茶空间遗传结构的相关研究

1．3 本研究的内容、目的与意义

第二章 香港红山茶个体内ITS多样性

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．2．3 实验药品

2．2．4 实验软件

2．3 实验方法

2．3．1 改进的CTAB法提取总DNA

2．3．2 ITS序列扩增

2．3．3 PCR扩增产物回收与纯化

2．3．4 测序

2．3．5 PCR产物测序

2．3．6 序列分析

2．4 结果

2．4．1 ITS序列重组子及单倍型检测

2．4．2 序列特征

2．4．3 个体内多态性

2．4．4 GC含量，最小自由能以及二级结构

2．4．5 系统发育树

2．4．6 物种鉴定

2．5 讨论

2．5．1 ITS序列的重组检测

2．5．2 ITS的假基因序列的判断标准

2．5．3 个体内ITS的多态性

2．5．4 ITS的进化

2．5．5 物种鉴定

第三章 山茶属植物种间及个体内26S rDNA的多态性

3．1 引言

3．2 材料与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．2．3 实验药品

3．2．4 实验软件

3．3 实验方法

3．3．1 改进的CTAB法提取总DNA

3．3．2 26S rDNA片段扩增及测序

3．3．3 序列分析

3．3．4 全基因组酶切、克隆rDNA并测序

3．4 实验结果

3．4．1 山茶属植物26S rDNA的序列特征

3．4．2 山茶属植物26S rDNA的多态性

3．4．3 山茶属植物26S rDNA的假基因

3．4．4 茶基因组内rDNA假基因的相对丰度

3．4．3 系统发育树

3．5 讨论

3．5．1 减少PCR介导的重组现象的方法

3．5．2 rDNA酶切及克隆

3．5．3 山茶属植物rDNA假基因的多态性

3．5．4 山茶属rDNA假基因的进化

3．5．5 山茶属rDNA假基因揭示的系统发育

第四章 杜鹃红山茶的空间遗传结构

4．1 引言

4．2 材料与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．2．3 实验药品

4．2．4 实验软件

4．3 实验方法

4．3．1 改进的CTAB法提取总DNA

4．3．2 SSR引物筛选

4．3．3 杜鹃红山茶荧光SSR-PCR扩增

4．3．4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染挑检PCR产物

4．3．5 带荧光标记的DNA分子片段检测

4．3．6 数据处理和分析

4．4 实验结果

4．4．1 杜鹃红山茶的遗传多样性

4．4．2 杜鹃红山茶的克隆生长

4．4．3 杜鹃红山茶亚种群间的分化

4．4．4 Bayesian推断的遗传结构

4．4．5 主成分分析的结果

4．4．6 瓶颈效应检测

4．4．7 空间自相关与空间遗传结构

4．4．8 最可能亲本分析与基因流

4．4．9 最小有效种群

4．5 讨论

4．5．1 杜鹃红山茶种群的遗传多样性

4．5．2 杜鹃红山茶种群内的基因流与遗传分化

4．5．3 杜鹃红山茶空间遗传结构模式及其原因

4．5．4 片段化生境对杜鹃红山茶种群的影响

4．5．5 杜鹃红山茶种群的有效种群大小及保护策略

第五章 结论和展望

5．1 主要结论

5．2 研究展望

参考文献

学习期间发表和拟发表的论文

致谢

附录

声明