免疫负调控分子sCTLA-4和sPD-L2-sCTLA-4融合蛋白的基因工程表达和初步功能研究

摘要

CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen4，细胞毒性T细胞相关抗原4)是一个表达于T细胞表面的蛋白分子，又称CD152，与CD28具有高度同源性，参与T细胞活化的负调控。PD-L2(Programmed cell death1 ligand2)是B7家族的第5个成员，PD-L2和其受体PD-1结合后，可以下调TCR信号，并最终抑制T细胞的活化。由于CTLA-4和PD-L2都能抑制病理性T细胞的活化，所以在器官移植和自身免疫病领域有着很好的前景。
　　以分泌表达His-CTLA-4膜外可溶性片段的毕赤酵母菌株为材料，批量发酵表达得到纯化蛋白，并在大鼠的类风湿性关节炎模型体内验证了其功效。为了开发治疗器官移植排斥和自身免疫疾病的新潜在药物，本实验室在先前研究的基础上，重新构建了不含His-tag的sCTLA-4毕赤酵母表达株，并通过多种方法对表达水平进行优化，但由于表达量仍然不理想并且不带标签，后续纯化步骤很难进行。因此我们重新构建了含His-tag和凝血酶识别切割位点的sCTLA-4表达载体pET-sCTLA-4，结果成功的表达和纯化了sCTLA-4蛋白，用凝血酶切除His-tag后，进一步的功能实验表明，在sCTLA-4终浓度为10ng/μ时，对小鼠双向混合淋巴细胞反应和ConA转化实验的抑制率分别达到69％和50％，具有显著的体外细胞免疫抑制功能。
　　另外，我们通过生物信息学原理及生物大分子结构与功能关系和免疫学相关知识，用基因工程的方法设计了一个新的双功能细胞分子——sCTLA-4-sPD-L2融合蛋白，它具有sCTLA-4和sPD-L2分子的双重功能。通过小鼠体外双向混合淋巴细胞反应、淋巴细胞转化实验表明sCTLA-4-sPD-L2融合蛋白能显著抑制小鼠淋巴细胞的活化，初步证明了其免疫负调控功能，为开发新型免疫抑制药物奠定了基础。

目录

摘要

第一部分 综述 免疫抑制药物的研究进展

(一)糖皮质激素类

(二)钙调磷酸酶抑制剂类

(三)抗代谢类药物

(四)磷脂酰肌醇3-激酶信号通路抑制剂

(五)新型生物制剂类

第一章 sCTLA-4的基因工程表达和功能实验

一、导论

二、材料

三、主要仪器设备

四、实验技术与方法

五、结果和讨论

第二章 sPD-L2-sCTLA-4融合蛋白的基因工程表达和初步功能研究

一．材料和方法

二．结果和讨论

论文总结

参考文献

致谢

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