肝细胞癌早期发现多重定量抗体芯片的构建及临床验证

摘要

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种进展快、预后差、侵袭性及转移性强的恶性肿瘤。在全球癌症病死率中已上升至第3位，在国内居第2位。由此可见，早期发现、早期诊断和早期治疗在肝癌研究中的重要性和迫切性。AFP是目前全世界应用最广泛的肝癌血清学标志物，但临床上约40％的肝癌患者血清AFP检测为阴性，在妊娠妇女、急慢性肝炎、生殖腺肿瘤和胃肠道肿瘤等人群中也可能升高;而影像学检查往往不能成为普查方式，且常在肿瘤长到0.5～1cm以上时才可见，早期发现概率不高。因此肝癌的早期诊断仅靠AFP易造成误诊和漏诊。为了弥补单一指标检测的不足，提高肝癌早期诊断的准确性，多个肿瘤标志物的联合检测已成必然趋势。
　　蛋白质组学技术的发展使得筛选新的肿瘤血清蛋白标志物成为可能。借助该技术，研究者们不仅发现了许多与肝癌早期发生发展存在密切联系的差异表达蛋白（潜在的肿瘤标志物）。还开辟了改善癌症相关血清标志物发现与鉴定的新途径—高灵敏度、高特异性、微型化，集成化，高通量化的抗体芯片技术。作为一种在基片表面固定多种高亲和性和高特异性抗体并可用于平行检测样本中蛋白表达水平的通量化蛋白质组学分析技术，它解决了传统的蛋白检测分析技术一次实验只能分析一种靶蛋白分子，在分析通量上难以满足对众多的潜在肿瘤血清蛋白标志物筛选分析的需求问题，并且已经向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等。因此，抗体芯片技术有可能发现与肝癌早期发生发展密切相关的血清蛋白标志物，这将极大地推进肝癌相关血清蛋白标志物的研究进展，为肝癌的早期诊断和治疗奠定基础。
　　研究技术路线:┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━┓┃用ELISA方法筛选有潜在临床应用价值的TM┃┃┣━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━┫┃↓┃┃用于肝癌早期发现定量抗体芯片的构建┃┣━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃┃→优化抗体芯片制备及检测的工作条件┃┃┃→考察构建定量抗体芯片方法的重复性及稳定性┃┃┃→ ELISA万法与定量抗体芯片方法的相关性分析┃┃┃→ELISA与定量抗体芯片的方法学比较┃┃┃┃┣━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃创建用于肝癌早期发现的判别模型┃┃↓┃┣━━━┳━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━┫┃┃多重定量抗体芯片的临床验证┃┃┗━━━┻━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━┛
　　第一部分 HCC早期发现肿瘤血清蛋白标志物的选择
　　肝癌早期诊断标志物的研究一直是肝脏疾病蛋白质组学研究的一个热点。人类肝癌发生的背景，绝大多数与肝炎病毒(HBV、HCV)的慢性持续性感染有关，有着乙肝病毒感染→慢性肝炎→肝硬化→肝癌的发生发展模式。
　　近年来，随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学技术的发展和应用，肝癌血清标志物的研究取得了新的进展，许多与早期诊断存在密切联系的潜在血清蛋白标志物被发现。据报道，在肿瘤的发生发展过程中，慢性炎症的刺激导致肿瘤释放许多直接促进其自身生长的因子，从而构成了炎性微环境，主要由肿瘤细胞、宿主细胞、细胞外基质、分泌因子等组成，各成分之间的交互作用形成一个庞大而复杂的网络系统，对肿瘤的发生发展具有重要的调控作用。因此，慢性病毒感染机体后，效应T细胞及Th细胞释放的多种细胞因子（IL-6、IL-10、TNF等），在体内构成免疫调节网络，作用于病毒感染的靶细胞，这些因子与相应受体结合，引起组织或器官的免疫病理损伤[1]，故检测肝癌患者体内血清细胞因子的含量能够在一定程度上反映病情的发生发展及预后。研究还发现，癌细胞及其间质细胞可分泌多种化学趋化因子及生长因子（IL-8、 HGF、TGF-β1、VEGF等）从而促进肿瘤血管生成及肿瘤浸润能力[2]，与HCC的发生发展、生物学行为及预后密切相关，已成为HCC预测的重要生物学标志物[3]。但研究发现肿瘤血清蛋白标志物均为非特异的肿瘤相关抗原，其单独检测肿瘤的敏感性及特异性有限。因此在积极研究探索新的肝癌早诊血清标志物的同时，对已经发现的潜在的肝癌早诊标志物进行全面、系统的血清学筛选和优化组合，从中挖掘出更多的具有临床诊断价值的血清标志物以早期发现和辅助诊断肝癌一直是蛋白质组学的努力方向。
　　为此我们运用传统的免疫分析方法—酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immune sorbentassay，ELISA)，对研究报道较多的、具有肿瘤早诊潜能的血清标志物进行检测，范围包括肝癌的蛋白质抗原、酶和同工酶、细胞因子等多方面。我们对50例肝癌患者和32例肝硬化患者血清，进行了15种蛋白质(HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL-10、TGF、VEGF、HCCR、SCCA、GPC3、GP73、DCP、AFP-L3、AFU、HSP27)浓度的定量检测，根据检测结果中15种蛋白质分别在HCC和LC患者血清中的浓度、上调及下调的趋势、P值，并以炎症性细胞因子与肝癌发生发展密切相关为依据，以构建多重定量抗体芯片中抗体间高度特异性的相关选择为目标，筛选和最终确定了AFP联合7种肿瘤血清蛋白标志物（主要以细胞因子），包括AFP、HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β1和VEGF作为构建多重肿瘤血清蛋白标志物联合定量抗体芯片检测系统的组成。
　　第二部分多重肿瘤血清蛋白标志物联合定量抗体芯片检测系统的构建
　　鉴于传统的肿瘤标志物的临床检测技术—ELISA、免疫组织化学(IHC)、放射免疫分析(RIA)等，只能检测单个或有限指标的局限性，以微列阵技术对生物样品作整体蛋白质表达分析的蛋白质芯片在后基因组时代越来越受到重视。抗体芯片(antibody microarray)是蛋白质芯片的一种，具有高通量、快速、平行分析生物样品、高信噪比和所需样本量少等优点，是检测生物样品中蛋白表达模式的新方法，已经逐渐发展成为平行性的定性和定量检测生物样品中蛋白质分子的重要平台，并能够较全面和准确地反映出在疾病的发生发展过程中的蛋白质表达水平的变化，尤其在对肿瘤的相关蛋白的分析研究中，通过筛选及鉴定具有临床应用价值的肿瘤标志物，进行肿瘤的早期诊断及治疗监测。目前临床常采用多肿瘤标志物(tumor markers，TM)联合检测，应用多变量分析方法，以利于肝癌筛查及早期诊断的准确性。为此，在第一部分工作的基础上，我们购置了与肝癌早期诊断相关的8种肿瘤血清蛋白标志物(AFP、HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL-10、TGF、VEGF)的标准品、单克隆抗体及抗体芯片等材料，运用双抗体夹心法确定了抗体间的最佳浓度，排除了各抗原、抗体之间交叉反应，实现了抗体的有效固定及理想的检测信号，获得了每个肿瘤标志物的检测范围、最低检测限、精密度及芯片的稳定性，实现了实验条件的优化研究，成功构建了可用于临床血清样品筛查的多重抗体芯片定量检测系统，并与传统的ELISA法在检测能力与相关性上进行了比较。结果显示，在一定浓度范围内，对于相同样品二种方法有很好的相关性。在此基础上，我们初步进行了临床验证。
　　第三部分多重肿瘤血清蛋白标志物联合定量抗体芯片检测系统的临床验证
　　利用构建的抗体芯片检测系统检测了218例血清样本，其中肝硬化患者58例，平均年龄46.7岁（23-68岁），男性46人，女性12人;肝癌患者160例，平均年龄46.5岁（22-71岁），男性128人，女性32人，均经临床确诊。通过定量检测8种常见肿瘤血清蛋白标志物（AFP联合7种细胞因子）分别在HCC及LC患者血清中的浓度，并对临床资料进行回顾性研究，应用SPSS软件做Logistic回归分析，利用训练集创建诊断模型，获得AFP联合7种细胞因子各单项指标及其联合的受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)、曲线下面积(area under the curve，AUC)以及Cut off值，并在测试集中验证了模型的诊断价值。结果显示8种肿瘤标志物Logistic回归模型的AUC为0.940（cut off值0.31），而AFP其AUC为0.665（cut off值20ng/ml），二者差异显著，p＜0.001。AFP联合7种细胞因子在训练集中诊断的敏感性为93.3％，特异性为83.3％，准确性为90.9％;在测试集中敏感性为89％，特异性为77.3％，准确性为86％，明显优于血清AFP的诊断能力，后者诊断的敏感性为70％，特异性为59％，准确性为64％。多重定量抗体芯片检测系统具有较高敏感性和特异性，AFP联合7种细胞因子诊断模型对肝癌早期诊断优于传统AFP，具有潜在的临床应用价值。验证流程:
　　结论
　　1.利用50例肝癌患者和32例肝硬化患者的血清，应用ELISA方法获取了15种具有潜在临床应用价值的肿瘤血清蛋白标志物的定量数据，筛选和最终确定了AFP联合7种细胞因子(HGF、IGF、IL-6、IL-8、I-10、TGF、VEGF)为多重肿瘤血清蛋白标志物联合定量抗体芯片检测系统的组成。
　　2.确立了双抗体夹心法对8种肿瘤标志物的检测范围、最低检测限、精密度、稳定性、ELISA法相关性及二者在检测能力上的的比较，成功构建了可用于临床血清样品筛查的多重肿瘤血清蛋白标志物联合定量抗体芯片检测系统。
　　3.应用多重定量抗体芯片检测系统结合临床样本，运用Logistic回归分析创立了AFP联合7种细胞因子的肝癌早期发现诊断模型，并验证了该模型潜在的临床应用价值。
　　潜在应用价值
　　1.可通量化检测血清中多种肿瘤蛋白标志物的抗体芯片的构建，有助于肝癌血清标志物的基础研究能尽快应用于HCC的临床早期诊断中。
　　2.AFP联合7种细胞因子作为肝癌早期发现的血清蛋白标志物，可提高肝癌早期诊断的敏感性、特异性和准确性。
　　创新点
　　1.运用双抗体夹心免疫分析法，首次构建了AFP联合HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL-10、TGF、VEGF的多重肿瘤血清蛋白标志物联合定量抗体芯片检测系统。
　　2.运用Logistic回归分析创立了HCC早期诊断模型，并通过对该模型的临床验证发现了8种肿瘤血清蛋白标志物具有潜在的临床应用价值。

目录

中英文缩略词对照表

摘要

引言

参考文献

第一部分 肝癌早期发现肿瘤血清蛋白标志物的选择

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 多重肿瘤血清蛋白标志物联合定量抗体芯片检测系统的构建

第一章 文献回顾

第二章 多重定量抗体芯片技术平台的构建

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 多重肿瘤血清蛋白标志物联合定量抗体芯片检测系统的临床验证

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

抗体芯片在肿瘤早期诊断中的应用

附录

致谢

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