第二代测序技术对于肝细胞癌的研究——外显子测序及转录组测序的发现及验证

摘要

研究背景和目的：
　　 原发性肝癌(Primary liver cancer，PLC)是世界第八大癌症，全球每年新发生肝癌约为100万例，并且每年会造成约50万人死亡。肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)约占成年人原发性肝癌的80-90％，在美国，肝细胞癌患者的五年生存率只有8.9％，流行病学调查显示，约有50％的肝细胞癌由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起。过去的几十年里，在驱动肝癌发生的分子机制方面有很多进展，许多基因都发现与肿瘤的发生发展有重要关系，例如抑癌基因(TP53，p16和p21)以及促癌基因(β-catenin，ErbB家族，COX-2和HGF)等。另外，肝癌细胞会发生大量基因组的改变，包括染色体不稳定性、CpG岛甲基化、DNA重排、核苷酸置换和微卫星不稳定等，体细胞遗传畸变已被证明是肿瘤发生发展的始动因素，包括单碱基替换、易位及基因组拷贝数变化，并且芯片技术早已被系统的应用于细胞基因组变化的研究。
　　 第二代测序技术(Next generation sequencing，NGS)能为肿瘤细胞中基因组的改变提供详细、特异的信息，并且能以较低的成本提供海量数据，这就为肿瘤组织基因组分析提供了一条便捷之路，最近，有报道称对于急性粒细胞白血病的全基因组测序已经通过Illumina/Solexa测序完成，这为肿瘤基因组学的进一步深入研究提供了良好的平台和工具。我们用第二代测序技术对肝癌组织进行了全外显子和转录组测序，通过外显子测序筛选出了一系列基因组拷贝数扩增的区段，还通过转录组测序在转录组水平筛选出了融合基因、新转录本及差异表达基因。
　　 实验方法：
　　 1.对肝癌患者的癌组织和癌旁组织进行全外显子和转录组测序，对数据进行分析、筛选；
　　 2.应用real-time PCR方法对测序以及芯片分别筛选出的拷贝数改变的区域进行进一步验证；对筛选出拷贝数扩增的区段进一步进行组织水平的免疫组化验证；
　　 3.扩大real-time PCR验证样本量，并对样本病历资料及部分样本的预后资料进行收集、整理和统计；
　　 4.对转录组测序筛选出的位于基因组拷贝数扩增区域的融合基因进行了常规测序的验证，并且通过5’及3’-cDNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)得到了融合基因的全长并进行了部分功能实验；
　　 5.对比SNP6.0芯片技术和二代测序技术对CNV筛选的准确性；
　　 6.验证了部分转录组测序中的发现。
　　 结果：
　　 通过外显子捕获技术的分析，发现本次对肝癌组织的测序平均每个外显子被覆盖30次，62％被捕获的基因测序覆盖率达到95％以上，接着，对癌组织及其相应的癌旁组织的相同外显子考倍数进行对比，然后，筛选出最明显的5％发生基因组拷贝数变化的区域作为候选，通过这一方法我们筛选出415个单个基因发生拷贝数变化，其中191个癌比癌旁扩增，224个削减，但由于这些单个基因主要为散在单发，在9对癌和癌旁组织中显有交集，因此，这些单个基因拷贝数变化在癌症发生发展中的作用很可能是累加而成，单个基因的变化可能在癌症过程中的作用并不大，为了进一步得到更有价值的数据，我们筛选了至少两个在基因组水平连接在一起的基因区段，并且总共得到了136个这样的区域，为了验证二代测序技术的准确性，我们随机对158对单个基因和86个多基因区段进行基因组DNA定量PCR验证，其中26.6％的单个基因和41.9％的多基因区段得到了验证，这一验证率明显高于我们用SNP6.0芯片技术发现的CNV区域的验证率，证明了测序技术检测CNV的先进性，接着，我们对9位忠者的血细胞进行了基因组DNA的定量PCR，发现大多数CNV为体细胞突变为了进一步研究其下游mRNA的变化，我们在mRNA水平上进行了转录组测序，结果显示，在外显子捕获技术筛选出的候选基因中约50％的单基因和75％的多基因区段在mRNA水平发生变化，这提示了多基因区段基因可能在癌症发生发展中起着更多的作用，其中11q13.2-13.3(覆盖24个基因)和19q13.2(覆盖26个基因)在基因组和转录组水平均发生了扩增，并且运用定量PCR技术得到了验证，在免疫组化水平也得到了证实，11q13区段曾经被报道过在肝细胞癌基因组水平发生扩增，但定位没有此次发现定位精确，19q13.2的扩增为首次报道。并在11q13.2-13.3区段发现其中两个原本不连续的基因PPFIA1-SHANK2在基因组和转录组水平发生融合，在得到融合基因全长之后，我们初步证明了融合基因在细胞迁移和侵袭中的作用。并且转录组测序的部分发现也得到了验证。
　　 结论：
　　 我们发现了11q13.2-13.3和19q13.2两个较为重要的发生拷贝数扩增的区域，前者曾经有人用比较基因组杂交等方法在肝癌中有报道，不过当时技术限制，区域较为广泛，此次定位更为精确，共覆盖24个基因；19q13.2为首次报道，共覆盖26个基因；在转录组测序的结果中，我们发现这两个区段扩增及基因差异表达均得到验证，并且在蛋白水平通过western blot和免疫组化的方法得到了验证。我们对首次报道的19q13.2区段进行了大样本量的检测，并对其扩增和样本的临床资料进行了相关性分析，发现扩增与TNM分期、包膜与否、BCLC分期、是否发生肝硬化以及肿瘤大小等恶性程度指标相关。通过全外显子测序和转录组测序，我们发现了与预后密切相关的11q13.2-3中两个原本不连续的基因PPFIA1和SHANK2发生了融合，并且通过RACE技术得到了融合基因的全长，在功能实验中发现了它对于迁移和侵袭的作用；在对全外显子测序和SNP6.0芯片技术检测CNV的比较中，我们发现测序技术的准确率要高于后者，另外我们还验证了转录组测序中的部分新发现。