苦瓜蛋白降脂活性成分纯化及功效评价

摘要

苦瓜是葫芦科苦瓜属植物苦瓜(Momordica charantia L, MC)的果实,原产于印度东部。现代研究证明苦瓜具有降血脂、降血糖、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等功效。本论文以新鲜苦瓜为原料,对苦瓜粗提物的降血脂活性进行了研究,并通过脂肪肝细胞模型从中筛选出降血脂活性肽MCP3-2,同时对苦瓜多肽的降脂机理进行了研究。
　　第一部分,绪论。概述了苦瓜的药理作用及其活性成分;介绍了高脂血症的危害及治疗措施,以及生物活性肽的研究进展;综述了苦瓜降血脂作用的研究方法及意义。
　　第二部分,苦瓜粗提物对SD大鼠的降血脂作用。通过喂食特殊加工的高脂饲料8周后建立高脂血症大鼠模型,建模成功后给予不同剂量(50、100和200mg/kg)的苦瓜粗提物和辛伐他汀(10mg/kg)。灌胃4周后,检测血脂和肝脂指标,计算脏器指数,并进行肝脏病理学观察。实验结果显示,不同剂量(50、100和200mg/kg)的苦瓜粗提物和辛伐他汀均可显著降低高脂血症大鼠的血脂浓度和肝脂浓度,另外对大鼠体重和脏器质量没有影响,但是可显著降低肾周脂肪质量。本实验中最佳有效剂量为100mg/kg,该剂量苦瓜粗提物可显著提高了HDL-C的浓度,同时降低LDL-C的浓度,降低动脉粥样指数,表明中剂量苦瓜粗提物具有一定抗动脉粥样硬化的作用。此外,苦瓜粗提物显著降低肝脏中ALT、AST和FFA浓度,对肝脏有保护功能。肝脏病理切片显示,苦瓜粗提物显著减少了肝细胞质内脂肪空泡的数量,对脂肪肝有一定的治疗作用。以上结果表明苦瓜粗提物各剂量组均能显著降低血清和肝脏中TG浓度,修复肝组织结构形态及功能,具有显著的利肝清脂的功效。
　　第三部分苦瓜多肽的分离纯化。本部分运用硫酸铵沉淀蛋白法和透析技术对苦瓜进行初步分离得到苦瓜粗提物(MCE),用Sephadex G-75凝胶层析柱对苦瓜粗提物进行初步分离得到3个级分:MCP-1、 MCP-2和 MCP-3。并结合体外降血脂实验,筛选出具有降血脂活性成分 MCP-3,利用 Sephadex G-25凝胶层析柱对MCP-3进行纯化得到3个级分,并筛选出具有降血脂活性成分MCP3-2和MCP3-3。利用分析技术确定了苦瓜粗提物及其级分的化学成分。结果表明,苦瓜的化学组成为:水分93.5％,灰分1.92%,粗蛋白1.93%,粗脂肪0.89%,多糖1.71%。经过纯化后,各个级分的蛋白质(多肽)含量都达到95%以上。并对级分进行氨基酸组成分析。结果表明:苦瓜粗提物中含量最高的氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸,三者约占氨基酸总含量的33.66%。MCP-1中含量最高的氨基酸为赖氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸,三者约占氨基酸总含量的31.68%。MCP-2中含量最高的氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸,三者约占苦瓜粗提物氨基酸总含量的32.64%。MCP-3中含量最高的是谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸,三者约占氨基酸总含量的39.65%。MCP3-1中含量最高的是谷氨酸、亮氨酸和酪氨酸,三者约占氨基酸总含量的26.13%。MCP3-2中含量最高的是天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸,三者约占氨基酸总含量的37.51%。MCP3-3中含量最高的是谷氨酸、丝氨酸和赖氨酸,三者约占氨基酸总含量的33.58%。结合体外降血脂活性实验,与其他非活性成分相比, MCP3-2和MCP3-3中丝氨酸和赖氨酸含量较高,这可能与其降血脂活性有关。
　　第四部分苦瓜多肽对 HepG2细胞甘油三酯代谢的影响及其机制。实验将MCP3-2、MCP3-3两个级分进行体外降血脂实验。本部分建立了游离脂肪酸(棕榈酸:油酸,2:1,FFA)孵育HepG2细胞建立非酒精性脂肪肝模型,建模成功后分别给予MCP3-2和MCP3-3各个剂量(10、25、50和100μg/mL)。孵育48h后检测细胞内TG含量和CPT1A酶活性,并利用倒置显微镜观察细胞内脂质沉积情况。实验结果显示,治疗组在治疗后,在甘油三酯指标上与模型组相比具有显著性差异(P<0.01),分别下降43.8%、47.5%。CPT1A酶活性与模型组相比具有显著性差异(P<0.05)。预防在治疗后,在甘油三酯指标上与模型组相比具有显著性差异(P<0.01),分别下降46.7%、56.5%。CPT1A酶活性与模型组相比具有显著性差异(P<0.05)。预防较治疗组具有更好的趋势,但无统计学差异。以上结果表明,苦瓜多肽能提高CPT1A酶的活性,加速脂肪酸在细胞水平的氧化,降低肝脏和血清中TG水平,在降低肝脏脂质沉积上起到重要作用。这可能是其降低甘油三脂的机制之一。

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第一部分 绪论

1.1国内外苦瓜开发利用研究

1.2国内外生物活性肽研究

1.3 课题研究的目的及意义

1.4 课题的研究内容

第二部分 苦瓜粗提物降血脂活性

2.1 实验材料与仪器

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 结论

第三部分 苦瓜多肽的分离纯化

3.1 实验材料与仪器

3.2实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 结论

第四部分 苦瓜多肽对HepG2细胞内甘油三酯代谢的影响及其机制

4.1 实验材料与仪器

4.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.4 结论

结论与展望

参考文献

致谢

附录Ⅰ氨基酸标准及乙醇分级沉淀紫外扫描图

附录Ⅱ 作者简介

附录Ⅲ 攻读硕士学位期间发表论文目录

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