互花米草谷胱甘肽合成及还原酶相关基因的克隆和功能鉴定

摘要

盐胁迫是影响植物生长和发育的重要非生物胁迫因子，它能引起次级胁迫-渗透胁迫和氧化胁迫。植物在胁迫下可以利用抗氧化系统清除活性氧，从而保护细胞和亚细胞结构。近年来，研究者在盐生植物中鉴定了大量与耐盐相关的基因，并进行了功能验证。研究表明，谷胱甘肽还原酶GR作为抗氧化酶在植物耐盐机制中发挥了重要作用。
　　为研究泌盐盐生植物互花米草（Spartina alterniflora）谷胱甘肽合成酶相关基因（SaOAS）及还原酶相关基因（SaGRC、SaGRP）的功能，本研究首先分析了互花米草幼苗在600 mmol/L NaCl和500μmmol/L CdCl2胁迫下叶片中谷胱甘肽还原酶GR的活性变化；其次，克隆出谷胱甘肽还原酶基因SaGRC、SaGRP和半胱氨酸合成酶基因SaOAS，构建过量表达载体后利用农杆菌介导法转化拟南芥和水稻，并对获得的阳性纯合转基因拟南芥株系进行相关生理生化测定和耐盐性分析。实验结果如下：
　　(1)胁迫处理对谷胱甘肽含量和谷胱甘肽还原酶活性的影响
　　分别用600 mmol/L NaCl和500μmmol/L CdCl2处理互花米草幼苗，结果显示，随着处理时间的增加，还原性谷胱甘肽含量呈现上升趋势。与此同时，谷胱甘肽还原酶活性呈现上升趋势，与非变性的聚丙烯酰氨凝胶电泳显示的总体活性相一致。
　　(2)基因的克隆和序列分析
　　利用3’-RACE和5’-RACE技术获得目的基因SaGRC、SaGRP、SaOAS，其中SaGRC为胞质型，SaGRP为线粒体型，两者序列同源性很高。SaGRC基因的开放阅读框为1479 bp，推导其编码492个氨基酸残基，SaGRP基因的开放阅读框为1659 bp，推导其编码532个氨基酸残基。SaOAS基因的开放阅读框为969 bp，推导编码322个氨基酸残基。
　　(3)基因表达水平的变化
　　分别用600 mmol/L NaCl和500μmmol/L CdCl2处理互花米草幼苗，结果显示，SaGRC、SaGRP、SaOAS基因的表达量均呈现先上升后下降的趋势，推测GR在互花米草抗逆机制中发挥重要作用。
　　(4)转基因拟南芥生理检测
　　对筛选出的过量SaGRC、SaGRP、SaOAS拟南芥株系进行基因表达定量分析，最终分别选取了2个株系进行种子萌发、弯根实验，以及相关生理生化指标的测定。结果显示，在不同浓度的NaCl处理下，转基因拟南芥的种子萌发情况优于野生型拟南芥，转基因株系的丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量等指标显示，转基因株系的耐盐性比野生型拟南芥有所提高。
　　(5)转基因水稻抗性检测
　　通过植物组织培养法获得的过表水稻出愈率约为85.4％，分化率约为23.7%。
　　其中，对过量表达SaGRC基因的水稻T2代株系进行定量表达分析和初步表型鉴定，并选取了10个株系进行扩繁，有待得到纯合株系，再进行生理生化指标的测定。

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文献综述

1 盐胁迫与植物的耐盐性

1.1 高盐对植物的毒害

1.2 植物的耐盐性

2 镉胁迫与植物的耐受性

3 植物谷胱甘肽和抗氧化胁迫

3.1 谷胱甘肽的合成与还原

3. 2 谷胱甘肽的抗氧化机制

3. 3 谷胱甘肽代谢的相关酶类

4 本实验的研究背景和研究意义

实验部分

第一部分：互花米草对NaCl胁迫的生理响应

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 实验结果

1.4 讨论

第二部分：互花米草SaGRC、SaGRP、SaOAS基因的克隆

2.1 实验材料、仪器及试剂

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三部分：互花米草SaGRC、SaGRP、SaOAS基因的表达谱分析

3.1 实验材料、仪器及试剂

3.2 实验方法

2.3 实验结果

3.4 讨论

第四部分：盐生植物互花米草SaGRC、SaGRP、SaOAS基因的过量表达

4.1 实验材料、仪器及试剂

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

小结

参考文献

致谢

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