间充质干细胞释放的微粒通过传递角质细胞生长因子mRNA保护内毒素所致的小鼠急性肺损伤

摘要

[目的]本研究组的先前研究证实，间充质干细胞能够通过细胞旁分泌的方式释放足量的角质细胞生长因子，这些生长因子在调节肺水清除率以及减轻肺水肿的过程中起了决定性作用。目前发现，间充质干细胞能够释放一种100纳米至1微米大小的膜微粒，这种类球型的无核颗粒包涵了众多来自于干细胞的蛋白质、mRNA、microRNA、细胞器以及脂质等成分，已经证实这些微粒在参与细胞间信号传递的过程中起了关键作用。鉴于这些线索，我们假定微粒可能部分通过传递角质细胞生长因子的mRNA至受损的肺泡上皮及肺内皮细胞从而保护急性肺损伤，拟通过本研究证实这一可能的作用机制。
　　[方法](1)人骨髓间充质干细胞释放微粒的分离提纯:将间充质干细胞置于条件培养液培养48小时后收集上清。经过超高速离心后分离微粒，按照10μl微粒相当于1×106的间充质干细胞的比例提纯微粒。(2)内毒素所致小鼠急性肺损伤模型的建立:小鼠经气管内给予内毒素(4mg/kg)建立急性肺损伤模型。按照不同的处理进行分组:内毒素+间充质干细胞气管给药治疗组(LPS+MSC):内毒素+间充质干细胞微粒静脉给药治疗组(LPS+1×MSC MV IV);内毒素+单倍剂量间充质干细胞微粒气管给药治疗组(LPS+1×MSC MV IT);内毒素+双倍剂量间充质干细胞微粒气管给药治疗组(LPS+2×MSC MV IT);内毒素+成纤维细胞微粒气管给药治疗组（LPS+NHLF MV）。(3)标本的采集和检测:48小时后对各组小鼠的外周血、肺泡灌洗液、肺组织进行细胞学、病理学研究。利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清及肺泡灌洗液中的MIP-2浓度，并用二辛可宁酸法测定肺泡灌洗液中的蛋白含量。(4)用KGF siRNA干扰处理间充质干细胞来干扰细胞释放的微粒中的KGF mRNA:行RT-PCR证实。(5)接着，用KGFsiRNA干扰微粒处理急性肺损伤小鼠模型:将小鼠随机分为内毒素组(4mg/kg);内毒素+间充质干细胞KGF siRNA干扰预处理微粒气管给药治疗组(LPS+KGFsiRNA MV);内毒素+间充质干细胞Negative siRNA干扰预处理微粒气管给药治疗组(LPS+Negative siRNA MV)。(6)标本的采集和检测:48小时后对各组小鼠的外周血、肺泡灌洗液、肺组织进行细胞学研究以及肺血管外水含量的检测。(7)小鼠肺巨噬细胞系RAW264.7细胞与间充质干细胞微粒的体外共培养:在不同时间点（6小时、12小时、24小时）收集培养液上清，用ELISA测定MIP-2、TNF-α、及IL-10的浓度。(8)统计学方法:用SPSS及Prism统计软件，变量以均数±标准差(mean±SD)表示，多组计量资料间比较采用one-way ANOVA分析及Bonferroni校正检验分析，两组间均数的比较采用t检验，以P＜0.05表示有统计学意义。
　　[结果](1)经气管给予人骨髓间充质干细胞释放的微粒能减少小鼠急性肺损伤模型肺泡灌洗液中白细胞的聚集:与单纯内毒素组相比，内毒素+间充质干细胞微粒组肺泡灌洗液中白细胞总数下降36％，P＜0.05;内毒素+间充质干细胞微粒组肺泡灌洗液中中性粒细胞计数亦下降73％，P＜0.05。(2)经气管给予人骨髓间充质干细胞释放的微粒能抑制小鼠急性肺损伤模型肺泡灌洗液中炎症细胞因子的释放以及蛋白的渗出:与单纯内毒素组相比，内毒素+间充质干细胞微粒组肺泡灌洗液中MIP-2含量下降49％，P＜0.05;内毒素+间充质干细胞微粒组肺泡灌洗液中总蛋白含量亦下降35％，P＜0.05。(3)经静脉给予人骨髓间充质干细胞释放的微粒同样能减少小鼠急性肺损伤模型肺泡灌洗液中的中性粒细胞并抑制蛋白的渗出:与单纯内毒素组相比，内毒素+间充质干细胞微粒静脉给药组的肺泡灌洗液中中性粒细胞计数下降49％，同时总蛋白含量亦下降34％，P＜0.05。(4)经气管给予人骨髓间充质干细胞释放微粒的剂量效应:当气管给予双倍剂量间充质干细胞释放的微粒时，肺泡灌洗液中性粒细胞及MIP-2含量较之单倍剂量的微粒仅有轻度下降，无统计学差异。(5) LPS体外刺激RAW264.7细胞与间充质干细胞及微粒共培养不同时间后上清液炎症因子的变化:与单纯LPS刺激组相比，干细胞组及微粒组在共培养6小时后IL-10水平明显上升，有统计学差异。12小时后，微粒组仍然较单纯LPS组明显升高。但24小时后，干细胞组及微粒组的IL-10水平回复至单纯LPS组水平;微粒组在共培养6小时后TNF-α水平明显下降，有统计学差异。12小时后，干细胞组及微粒组TNF-α水平均有减少，且趋势持续至24小时;微粒组在共培养6小时后MIP-2水平明显下降，有统计学差异。12小时后，干细胞组及微粒组MIP-2水平均有减少，且趋势持续至24小时，变化趋势类似于TNF-α。(6) KGF siRNA干扰处理的间充质干细胞微粒对于急性肺损伤小鼠模型的作用:与内毒素+Negative siRNA干扰预处理微粒组相比，内毒素+KGFsiRNA干扰预处理微粒组肺泡灌洗液中中性粒细胞计数上升47％;内毒素+KGFsiRNA干扰预处理微粒组肺泡灌洗液中MIP-2含量上升56％。(7)急性肺损伤小鼠模型肺血管外水含量的变化:与单纯内毒素组相比，给予间充质干细胞释放的微粒组的肺血管外水含量减少45％，其保护作用类似于间充质干细胞组;与内毒素+Negative siRNA干扰预处理微粒组相比，内毒素+KGF siRNA干扰预处理微粒组的肺血管外水含量增加24％。
　　[结论](1)在内毒素所致的小鼠急性肺损伤模型中，无论是静脉还是气管给药，人骨髓间充质干细胞释放的微粒能抑制炎症细胞（如中性粒细胞）的聚集，减少炎症因子（如MIP-2）的释放以及肺泡内蛋白的渗出;(2)更重要的是，给予间充质干细胞微粒能减少肺血管外水含量（反映肺水肿的指标）;(3)间充质干细胞释放微粒的保护作用类似于间充质干细胞本身;(4)间充质干细胞释放的微粒包涵KGF mRNA，之前的研究已经证实KGF是间充质干细胞分泌的因子，参与维持肺泡内液体清除的功能;(5)无论是静脉还是气管给予间充质干细胞释放的微粒，肺泡灌洗液中KGF蛋白的含量均明显升高;(6)经KGF siRNA干扰处理的间充质干细胞微粒，其保护作用部分消失，结果提示微粒可能部分通过传递KGF mRNA至受损的肺泡上皮细胞及肺内皮细胞并促进KGF蛋白的释放来达到保护的作用;(7)体外试验亦证实间充质干细胞微粒能抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的促炎症因子的释放，同时促进抗炎因子如IL-10的释放，结果提示微粒具有类似于间充质干细胞的免疫调节的作用。

目录

中英文缩写索引

摘要

前言

参考文献

第一部分 人骨髓间充质干细胞释放的微粒对内毒素所致小鼠急性肺损伤的保护作用

材料和方法

结果

第二部分 人骨髓间充质干细胞释放微粒的保护作用部分由传递角质细胞生长因子mRNA介导

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

致谢

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