含角质细胞生长因子－2的生物美容护肤品和重组人角质细胞生长因子－2的制备方法

摘要

本发明公开了一种包括角质细胞生长因子－2的生物美容护肤品，由以下产品组成：KGF－2冻干粉：1重量份，KGF－2专用溶媒：1000－10000重量份，其中：KGF－2冻干粉中包括1重量份KGF－2和100－500重量份KGF－2稳定剂。本发明的产品避免了传统活性物质与化妆品基质长期混合使生物活性物质失活，保持KGF－2强大的生物活性。主要用于日常美容皮肤的护理，以及问题皮肤的护理，如面部泛黄、无光泽、松弛、面部皱纹、眼袋、黑眼圈、毛孔粗大、粉刺、痤疮、色斑、红血丝、晒伤、划伤、皮肤敏感以及美容手术伤口等。

说明书

技术领域

本发明是关于一种生物美容护肤化妆品，更特别的是关于一种含角质细胞生长因子-2的生物美容护肤品和重组人角质细胞生长因子-2的制备方法

背景技术

角质细胞生长因子-2(KGF-2)是成纤维细胞生长因子(FGF)家族中最新被克隆的一个成员，是利用人类基因组计划研究结果开发的第一个基因组药物，是机体内自然存在的一种具有活性的可溶性蛋白质，编码208个氨基酸，主要由皮下组织细胞分泌，并特异性的结合到上皮细胞表面的特异受体经过复杂的信号传递过程，启动上皮细胞内参与分裂生长的基因表达，从而刺激上皮组织的新陈代谢。

国外学者在生物学功能方面作过比较系统的深入研究，包括：

1、促进上皮细胞的增生和发育。角质细胞生长因子刺激角质细胞合成的能力比TGF和EGF强2至10倍；还可促进肺泡上皮、胰管、胃肠道上皮以及乳腺上皮细胞增生和精囊发育。

2、促进伤口愈合，小鼠皮肤切割实验显示角质细胞生长因子能有效快速促进伤口愈合；静脉注射角质细胞生长因子能明显降低急性实验中小肠的损伤度和慢性实验中小肠的溃疡程度。

3、刺激胎儿肺部液体分泌。

4、具明显的抗辐射损伤作用；

5、参与卵泡发育及子宫内膜着床的调节。

正是因为有这些生物学特点，角质细胞生长因子在医学临床和美容方面有巨大的应用价值。

KGF-2是一种碱性蛋白，它属于成纤维细胞生长因子家族(FGF)，又名FGF-10。这种细胞生长因子与目前美容领域里所用的aFGF，bFGF等成纤维细胞因子不同，它仅作用于上皮细胞，而不作用于成纤维细胞和内皮细胞。而且与FGF-10与FGF-7相比，这种细胞生长因子的作用更专一。经相关试验证明，该细胞生长因子用于皮肤是安全的，无毒、不会产生突变等副作用。

作用机理：KGF-2与细胞表面的特异性受体结合后，经过信号传导途径，促进上皮细胞的生长、分化和迁移；同时也启动上皮细胞对皮下组织的协同信号反馈，促进皮肤各组织的新陈代谢平衡，改善包括结缔组织在内的皮肤各组织的功能，增加皮肤的弹性，使肌肤焕发出新的生命力。

发明内容

本发明针对KGF-2的生物学功能特点提出将KGF-2应用于美容护肤化妆品中，根据其生物活性特点提供一种用于美容护肤的KGF-2护肤素包括KGF-2冻干粉和专用溶媒混合使用，避免化妆品基质长期混合影响KGF-2活性，十分有效地发挥其对皮肤的营养和护理作用。

本发明并且提供了一种新的重组人角质细胞生长因子-2的制备方法。

本发明的这些以及其他目的将通过下列详细说明和描述来进一步展开和阐述。

在本发明中，一种包括角质细胞生长因子-2的生物美容护肤品，由以下产品组成：：

      KGF-2冻干粉：                    1重量份，

      KGF-2专用溶媒：         1000-10000重量份，

其中：KGF-2冻干粉中包括1重量份KGF-2和100-500重量份KGF-2稳定剂，所述的稳定剂包括缓冲剂、渗透压调节剂和填充剂。

进一步的，本发明的包括角质细胞生长因子-2的生物美容护肤品，由以下产品组成：

      KGF-2冻干粉：                    1重量份，

      KGF-2专用溶媒：          2000-6000重量份，

其中：KGF-2冻干粉中包括1重量份KGF-2和200-500重量份KGF-2稳定剂，所述的稳定剂包括缓冲剂、渗透压调节剂和填充剂。

较好的是，本发明的包括角质细胞生长因子-2的生物美容护肤品，由以下产品组成：

      KGF-2冻干粉：                    1重量份，

      KGF-2专用溶媒：          3000-5000重量份，

其中：KGF-2冻干粉中包括1重量份KGF-2和200-400重量份KGF-2稳定剂，所述的稳定剂包括缓冲剂、渗透压调节剂和填充剂/冷冻保护剂。

在本发明的角质细胞生长因子-2的生物美容护肤品中，在KGF-2稳定剂中所述的缓冲剂可以是磷酸盐、乌头酸、柠檬酸、戊二酸、苹果酸和琥珀酸之一，渗透压调节剂可以是氯化钠，填充剂/冷冻保护剂可以是蔗糖、甘氨酸、甘露醇、海藻糖或其他药学可接受的填充剂，可以单独使用其一，也可以使用其混合物。

进一步的，在本发明的角质细胞生长因子-2的生物美容护肤品中，在KGF-2稳定剂中含有：

浓度约为5-20mM的缓冲剂，

浓度约为0.01-12.5mM的氯化钠，

浓度约为2-15％W/V的蔗糖、甘氨酸、甘露醇或海藻糖中的一种或多种，和水。

在本发明的包括角质细胞生长因子-2的生物美容护肤品中，当作为KGF-2护肤素时，其溶媒配方为：

透明质酸    0.05-0.2％    卡波树脂    0.05-0.2％

尿囊素       0.1-0.3％    DC-193       0.4-0.7％

胶原蛋白       0.5-2％    聚季铵盐     0.4-0.6％

EDTA         0.1-0.3％    双咪唑烷基脲  0.3-0.5％

三乙醇胺         1-3％    维生素E     0.15-0.35％

余量为水。

在本发明的包括角质细胞生长因子-2的生物美容护肤品中，当在对皮肤修复中使用时，其溶媒配方为：

透明质酸    0.015-0.04％    双咪唑烷基脲    0.05-0.2％

氮酮          0.15-0.4％    多种维生素      0.15-0.3％

余量为水。

在本发明的包括角质细胞生长因子-2的生物美容护肤品中，当在对皮肤修复中使用时，其溶媒配方为：

透明质酸    0.015-0.04％    双咪唑烷基脲    0.05-0.2％

氮酮          0.15-0.4％    多种维生素      0.15-0.3％

二苯酮-4           3-7％    余量为水。

在本发明的包括角质细胞生长因子-2的生物美容护肤品中，其中KGF-2冻干粉的制备方法为：将0.2克rhKGF-2和60克稳定剂，加入1000ml去离子水，过滤除菌，无菌分装1000瓶，冷冻干燥20-40小时。

可以选择的是，本发明的重组人角质细胞生长因子-2，可以按以下步骤来制备：

A、选用人肺cDNA文库为模板进行PCR扩增目的基因片段；

B、加入正负链引物各50pmol，模板DNA，Tap酶1μl，含镁离子Buffer3μl，dNTP各2.5mmol/ml，总体积30μl，覆盖石蜡油，首先94℃预热5min，PCR循环参数94℃45s，59℃45s，72℃ 45s共30个循环，然后72℃延伸10min，取6μlPCR产物用1％琼脂糖进行电泳检查，其中：

正链引物为5｀GGGAATTCCATATGCTTGGTCAGGACATGGTGTCACCA3｀

负链引物为5｀TGCGCAGGATCCCTATGAGTGTACCACCATTGGAAGA3｀

C、通过上述PCR技术从人肺cDNA文库中合成KGF-2的cDNA，应用DNA重组技术，将目的片段亚克隆在表达载体pET21质粒上，用CaCl₂转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，对转化后大量的单克隆菌落通过酶切鉴定、序列测定分析和表达实验，获得高表达工程菌KGF-2(BL21/pET)；

D、离心收集菌体，匀桨破壁收集上清液，经过SP-HP层析和Superdex-75凝胶层析纯化得到纯度大于95％的KGF-2，具有与天然的KGF-2相同的生物活性。

在本发明中，可以使用按本发明所述的方法制备出的角质细胞生长因子-2(KGF-2)和稳定剂及溶媒，也可以使用市售的其他角质细胞生长因子-2(KGF-2)和稳定剂及溶媒，如中国专利中公开的那些角质细胞生长因子-2(KGF-2)及其制备方法和检测方法均可使用在本发明中。较好的是使用美国人类基因组科学公司出品的产品，这些产品均在中国申请了专利，如：CN-95197779.2、CN-00809802.6、CN-00812341.1和上海新生物医药研究有限责任公司研究的角质细胞生长因子-2(KGF-2)和稳定剂及溶媒，上述专利的产品在本发明中列入作为一部分使用。

本发明的含角质细胞生长因子-2(KGF-2)的生物美容护肤品主要用于：损伤性皮肤(如换肤、晒伤、敏感、点斑、去痣、纹刺等)的快速修复；皮肤晦暗、泛黄、无光泽、松弛多皱、肤质差、暗疮等问题皮肤的日常修护。

因此，本发明的含角质细胞生长因子-2(KGF-2)的生物美容护肤品在美容领域中具有以下的用途：

1、促进组织细胞再生，增强细胞代谢活力，抗衰老；促进老化皮肤更新、增强抗皱性。角质细胞生长因子促进上皮细胞的生长、分化和迁移，使新生的表皮细胞取代衰老的角质细胞，维持皮肤厚度，防止水分散失，达到使皮肤细嫩而富光泽的目的，同时角质细胞因子可以防止结缔组织大量取代脂肪组织，维持两者处于适当比例，避免真皮过度增厚，防止皮肤变皱。另外，老化的表皮细胞的得到不断的更新可以阻碍各种微生物和病原体对皮肤的侵袭，防止皮肤病的发生。

2、清除皮肤色素沉着、色斑、疤痕及痤疮。因为它可以上皮细胞的分化和迁移，使表皮细胞的代谢和更新加速，避免色素在皮肤上沉积形成色斑。

3、促进烧伤、各种外科创伤和手术伤口及外科溃疡的愈合。对于美容手术、修复伤口不易留下疤痕。

4、对皮肤晦暗、泛黄、无光泽、松弛多皱、暗疮等问题皮肤进行日常修复，特别针对损伤性皮肤(如换肤、晒伤、敏感、点斑、纹刺等)的快速修复。

在本发明中使用的所有原材料和设备及仪器和工具等均是常规使用的，可以从市场购得。

在本发明中，如非特指，所有的量、百分比等均为重量单位。

以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但实施例仅用于说明，并不能限制本发明的范围。

具体实施方式

例1：重组人角质细胞生长因子2的制备

我们选用人肺cDNA文库(Clontech)为模板进行PCR扩增目的基因片段。加入正负链引物各50pmol，模板DNA，Tap酶1μl，含镁离子Buffer 3μl，dNTP各2.5mmol/ml，总体积30μl，覆盖石蜡油，首先94℃预热5min，PCR循环参数94℃ 45s，59℃ 45s，72℃ 45s共30个循环，然后72℃延伸10min，取6μlPCR产物用1％琼脂糖进行电泳检查。

正链引物为5｀GGGAATTCCATATGCTTGGTCAGGACATGGTGTCACCA3｀

负链引物为5｀TGCGCAGGATCCCTATGAGTGTACCACCATTGGAAGA3｀

通过上述PCR技术从人肺cDNA文库从合成KGF-2的cDNA，应用DNA重组技术，将目的片段亚克隆在表达载体pET21质粒上，用CaCl2转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，对转化后大量的单克隆菌落通过酶切鉴定、序列测定分析和表达实验，获得高表达工程菌KGF-2(BL21/pET)，且传代稳定，该工程菌诱导后目的蛋白表达量占总蛋白表达量的20％以上且以可溶形式表达。离心收集菌体，匀桨破壁收集上清液，经过SP-HP层析和Superdex-75凝胶层析纯化得到纯度大于95％的KGF-2，具有与天然的KGF-2相同的生物活性。

例2：KGF-2冻干粉的制备

将0.2克rhKGF-2和60克稳定剂，加入1000ml去离子水，过滤除菌，无菌分装1000瓶，冷冻干燥20-40小时得KGF-2冻干粉。

其中：稳定剂的配方为：

浓度约为8mM的柠檬酸钠，

浓度约为0.1mM的氯化钠，

浓度约为5％W/V的蔗糖(7％)、甘露醇(5％)和海藻糖(8％)和水。

其PH值范围为：5.5-8.0，较好的是6.3。

例3：KGF-2护肤素的制备

专用溶媒配方：               (％)

透明质酸                     0.1

卡波树脂                     0.1

尿囊素                       0.2

DC-193                       0.6

胶原蛋白                     1

聚季铵盐                     0.5

EDTA                         0.2

双咪唑烷基脲                 0.4

三乙醇胺                     2

维生素E                      0.25

余量水。

上述配方无菌分装成5-10ml瓶装专用溶媒。使用时用1瓶溶媒溶解实施例2中的冻干粉1支，在早晚洁面后擦在脸上。

例4：KGF-2在美容手术后对皮肤修复中的应用

专用溶媒配方：               (％)

透明质酸                     0.025

双咪唑烷基脲                 0.1

氮酮                         0.25

多种维生素                   0.25

余量水。

上述配方无菌分装成10-15ml瓶装专用溶媒。使用时用1瓶溶媒溶解实施例二中的冻干粉1支，在美容手术后直接喷在脸上。

例5：KGF-2在皮肤防晒和晒伤修复中的应用

专用溶媒配方：                (％)

透明质酸                      0.025

双咪唑烷基脲                  0.1

氮酮                          0.25

多种维生素                    0.25

二苯酮-4                      5

余量水。

上述配方无菌分装成15-20ml瓶装专用溶媒。使用时用1瓶溶媒溶解实施例二中的冻干粉1支，直接喷在需要防晒的部位。

例6：KGF-2冻干粉的制备

将0.2克rhKGF-2和30克稳定剂，加入1000ml去离子水，过滤除菌，无菌分装1000瓶，冷冻干燥20-40小时得KGF-2冻干粉。

其中：稳定剂的配方为：

浓度约为10mM的柠檬酸钠，

浓度约为5mM的氯化钠，

浓度约为8％W/V的蔗糖(0.5％)、甘氨酸(2％)和水。

其PH值范围为：6.4。

例7：KGF-2护肤素的制备

专用溶媒配方：               (％)

透明质酸                     0.05

卡波树脂                     0.05

尿囊素                       0.1

DC-193                       0.4

胶原蛋白                     0.5

聚季铵盐                     0.4

EDTA                         0.1

双咪唑烷基脲                 0.3

三乙醇胺                     1

维生素E                      0.15

余量水。

上述配方无菌分装成5-10ml瓶装专用溶媒。使用时用1瓶溶媒溶解实施例2中的冻干粉1支，在早晚洁面后擦在脸上。

例8：KGF-2在美容手术后对皮肤修复中的应用

专用溶媒配方：               (％)

透明质酸                     0.015

双咪唑烷基脲                 0.05

氮酮                         0.15

多种维生素                   0.15

余量水。

上述配方无菌分装成10-15ml瓶装专用溶媒。使用时用1瓶溶媒溶解实施例二中的冻干粉1支，在美容手术后直接喷在脸上。

例9：KGF-2在皮肤防晒和晒伤修复中的应用

专用溶媒配方：               (％)

透明质酸                     0.015

双咪唑烷基脲                 0.05

氮酮                         0.15

多种维生素                   0.15

二苯酮-4                     3

余量水。

上述配方无菌分装成15-20ml瓶装专用溶媒。使用时用1瓶溶媒溶解实施例二中的冻干粉1支，直接喷在需要防晒的部位。

例10：KGF-2冻干粉的制备

将0.2克rhKGF-2和80克稳定剂，加入1000ml去离子水，过滤除菌，无菌分装1000瓶，冷冻干燥20-40小时得KGF-2冻干粉。

其中：稳定剂的配方为：

浓度约为20mM的磷酸钠，

浓度约为12.5mM的氯化钠，

浓度约为15％W/V的蔗糖(5％)、甘露醇(5％)和海藻糖(5％)和水。

其PH值范围为：6.2。

例11：KGF-2护肤素的制备

专用溶媒配方：                (％)

透明质酸                      0.2

卡波树脂                      0.2

尿囊素                        0.3

DC-193                        0.7

胶原蛋白                      2

聚季铵盐                      0.6

EDTA                          0.3

双咪唑烷基脲                  0.5

三乙醇胺                      3

维生素E                       0.35

余量水。

上述配方无菌分装成5-10ml瓶装专用溶媒。使用时用1瓶溶媒溶解实施例2中的冻干粉1支，在早晚洁面后擦在脸上。

例12：KGF-2在美容手术后对皮肤修复中的应用

专用溶媒配方：                (％)

透明质酸                      0.04

双咪唑烷基脲                  0.2

氮酮                          0.4

多种维生素                    0.3

余量水。

上述配方无菌分装成10-15ml瓶装专用溶媒。使用时用1瓶溶媒溶解实施例二中的冻干粉1支，在美容手术后直接喷在脸上。

例13：KGF-2在皮肤防晒和晒伤修复中的应用

专用溶媒配方：                (％)

透明质酸                      0.04

双咪唑烷基脲                  0.2

氮酮                          0.4

多种维生素                    0.4

二苯酮-4                      7

余量水。

上述配方无菌分装成15-20ml瓶装专用溶媒。使用时用1瓶溶媒溶解实施例二中的冻干粉1支，直接喷在需要防晒的部位。

例14：KGF-2冻干粉的制备

将0.2克rhKGF-2和90克稳定剂，加入1000ml去离子水，过滤除菌，无菌分装1000瓶，冷冻干燥20-40小时得KGF-2冻干粉。

其中：稳定剂的配方为：

浓度约为10mM的柠檬酸钠，

浓度约为20mM的氯化钠，

1mM的PH为6.2的EDTA二钠。

7％的蔗糖。

其PH值范围为：6.2。

正链引物为5｀GGGAATTCCATATGCTTGGTCAGGACATGGTGTCACCA3｀

负链引物为5｀TGCGCAGGATCCCTATGAGTGTACCACCATTGGAAGA3｀