Stanford A型主动脉夹层基因表达谱生物学通路分析与基因调控网络构建

摘要

本文从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 Stanford A型主动脉夹层基因表达谱检测及其生物学通路分析
　　目的：主动脉夹层是发生在主动脉的最常见的致命性疾病。急性主动脉夹层特别是Stanford A型主动脉夹层尤为凶险。主动脉夹层的一些危险因素己被确定，如遗传性结缔组织病。但到目前为止，主动脉夹层，尤其是无遗传背景的主动脉夹层的发病机制尚未明确。本研究拟检测主动脉夹层的基因表达谱，并对其进行生物学通路分析。
　　方法：获取急性Stanford A型主动脉夹层患者与器官捐献者的升主动脉组织，以人类全基因组表达谱微阵列芯片检测基因表达谱，以GenomeStudio GeneExpression Module v1.0软件进行数据结果分析，筛选差异表达基因;以KEGG数据库对差异表达基因进行通路分析。
　　结果：1）用t-Test unpaired unequal variance(Welch)算法得到差异基因数1309个，其中在主动脉夹层组中表达上调的基因630个，下调的基因679个。2）KEGG通路分析中有72个通路P值小于0.05，其中P值小于0.01的有37个，包括了粘着斑通路、血管平滑肌收缩通路、肌动蛋白细胞骨架通路和细胞外基质受体相互作用相关通路。3)粘着斑通路中的基因数为201个，差异表达的基因数为30个。整联蛋白α亚单位的多个基因如1TGA2、ITGA5、ITGA7、ITGA8的表达均有变化。另一个跨膜蛋白小窝蛋白(caveolin)的基因表达也下调。整联蛋白下游胞质内的衔接蛋白包括辅肌动蛋白(actinin)、粘着斑蛋白(vinculin)、丝蛋白(filamin)的基因表达均下调。此外，粘着斑通路中信号转导的关键点整联蛋白结合激酶(integrin-linked kinase，ILK)的基因表达在主动脉夹层组也下调。4）血管平滑肌收缩通路中包含的基因数为115个，差异表达的基因数为17个。在主动脉夹层组中血管平滑肌收缩相关通路的差异基因呈现一致的下调趋势。血管平滑肌细胞膜上钾离子通道和受体相关的基因如KCNMB1、KCNMA1、ADRA1 B、AGTR1、RAMP1、RAMP3下调;通路中游多种酶相关的基因PLCB4、ADCY9、PPP1R12A、PPP1 R12B、PPP1R14A均下调;通路末端编码肌动蛋白、肌球蛋白组分的基因如ACTG2、MYL9、MYH11、MYLK表达也下调。5）肌动蛋白细胞骨架通路包含的基因数为216个，差异表达的基因数为22个。其中包括与前述2个通路共有的ITGA2、ITGA5、I TG A7、ITGA8、ACTN4、VCL、MYL9、MYLK、PPP1R12A、PAK7、PIK3R1、PIK3R2、PDGFD等基因。而且该通路中编码丝切蛋白.2(cofilin-2)和凝溶胶蛋白(gelsolin)的基因CFL2和GSN在主动脉夹层组下调。6）细胞外基质受体相互作用通路中包含的基因数为84个，差异表达的基因数为16个。胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ的基因表达在主动脉夹层组上调，包括COL1A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2、COL6A3。另一种与粘着斑连接的细胞外基质蛋白层粘连蛋白在主动脉夹层组也变化，LAM A4、LAMB1、LAMB3上调，而LAMA3下调。7）在出现差异的37条通路中也包含了细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路和JAK/STAT信号通路等与炎症反应的调节密切相关的通路。
　　结论：我们的研究显示在并非由遗传性结缔组织病、先天性疾病引发的急性主动脉夹层患者的主动脉组织中，确实存在大量差异表达的基因。生物学通路分析发现基因在转录水平发生的异常出现在了血管平滑肌细胞的粘着斑通路、平滑肌收缩相关通路、肌动蛋白细胞骨架相关通路和细胞外基质受体相互作用通路。我们的结果提示主动脉中膜中的血管平滑肌细胞可能是急性主动脉夹层发生发展过程中的关键点之一。
　　第二部分 Stanford A型主动脉夹层基因调控网络构建
　　目的：本研究中拟用基因集富集分析和创新的表达模块分析方法以及STRING数据库进一步分析主动脉夹层的基因表达谱，构建以关键基因为中心的基因调控网络，探讨Stanford A型急性主动脉夹层的发病机制。
　　方法：本研究筛选差异表达基因后采用基因集富集分析和创新的数据分析方法——表达模块分析方法，寻找表达模块。使用STRING数据库构建JAK2炎症网络。使用网络本体分析研究JAK2网络的功能。实时荧光定量PCR验证IL-6，KITLG和CCL2的表达水平。
　　结果：1）差异基因显著性排序前25个基因包括在主动脉夹层组中上调的CDC45L, ST14, CKAP2L, TIMP1, PHLDA0, LHFPL2, PCSK0, GINS2,TMEM158,TSPANS，ECT2，CCDC34，VARS，CDC7，NT5DC2，LOC646993和PPIF，以及下调的RYR2，C5ort24，JAK2，REEP1，THSD4，BRP44L，RNF115和BAMBI。2）基因集富集分析和表达模块分析方法探测出8个表达模块，种子基因分别是PER2，CNN1，MCM2，APITD1，JAK2，HIF1A，IL1R1和CDC45L。3）在放大的JAK2表达模块中，JAK2位居模块的中枢，与其它基因，例如IL-6/IL-6R，CCL2，IFNGR1/2，EPOR和KITLG，形成差异表达高密度的子网络。4）通过STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用的网络中JAK2依然是网络的中心，与IL-6/IL-6R，CCL2，IFNGR1/2，EPOR和KITLG之间存在直接的相互关系。5）用RT-PCR的方法证实在主动脉夹层组中IL-6，CCL2和KITLG的表达明显上调。6）对所构建的JAK2网络进行的网络本体分析显示该网络的功能集中在JAK2的活化和STAT的酪氨酸磷酸化。
　　结论：本研究用不同的方法和数据库分别构建了以JAK2为中心的调控网络，得到了相似的结果。IL-6/IL-6R，CCL2，IFNGR，EPOR和KITLG在主动脉夹层中明显上调，并一致归结到JAK2，呈现出以JAK2为核心的调控网络。提示在主动脉夹层中，IL-6，CCL2，IFN-γ，EPO和KITLG这些细胞外配体及其相应受体的异常，均与JAK2构成相互作用，并通过JAK/S TAT通路，影响了细胞的功能。

目录

缩略语表

摘要

引言

参考文献

第一部分 Stanford A型主动脉夹层基因表达谱检测及其生物学通路分析

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 Stanford A型主动脉夹层基因调控网络构建

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述 主动脉夹层分子发病机制研究进展

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