脊髓脂氧素在大鼠神经病理性疼痛及电针镇痛中的作用及其机制研究

摘要

神经病理性疼痛(Neuropathic Pain，NP，简称神经痛)是由躯体感觉神经系统的损伤或相关疾病而造成的疼痛。神经痛是作为一类常见的慢性疼痛，与许多影响周围和中枢神经系统的疾病有关，如三叉神经痛、带状疱疹后神经痛(PHN)、糖尿病痛性神经病(DPN)、脑卒中后、帕金森病(PD)及多发性硬化(MS)等疾病。按国际上神经痛普通人群中的发病率约为8％推算，中国约有0.9亿神经痛患者。神经痛日益影响患者情绪及生活质量，严重则可致残疾，已成为公众关注的重要健康疾病。因此，深入探讨神经痛的发病与治疗机制，在临床与基础中均具有十分重要的意义。
　　近年来的研究证实，脂氧素(Lipoxins，LXs)作为机体一类内源性的抗炎脂类介质，是来源于花生四烯酸、经脂氧合酶(Lipoxygenase，LO)催化合成的一类生物活性物质。在哺乳动物中，LXs主要包括脂氧素A4(LXA4)和脂氧素B4(LXB4)，因其在抗炎和促炎症消退中发挥重要的作用，而喻为炎症的“刹车信号”。
　　针灸作为祖国传统医学中一重要的治疗方法，在临床中常用于治疗各种神经痛，在基础研究中其抗炎镇痛作用亦比较明确。以往研究表明，AA相关代谢物和酶（前列腺素、COX-2、白细胞三烯等）在疼痛及电针抗炎镇痛中发挥重要作用，此外合成LXA4中的重要酶5-LO亦介导神经痛的发展。
　　综上所述，本论文拟在神经痛模型上，采用行为学、分子生物学等技术开展以下研究:(1)观察神经痛动物模型第7天，ATL对神经痛大鼠机械痛行为学和脊髓炎症因子的影响;(2)观察脊髓JAK2-pSTAT3在神经痛及ATL抗炎镇痛中的作用;(3)观察电针对神经痛行为学的影响，分析电针抗炎镇痛的分子机制。
　　实验结果如下:
　　第一部分 脂氧素类似物ATL对神经痛大鼠机械痛及脊髓炎性细胞因子表达变化的影响
　　1.神经痛大鼠的机械性痛觉超敏及热痛觉过敏行为学变化
　　将大鼠随机分为3组，正常组(Normal)、假手术组（Sham）和模型组(Model)，每组8只。模型大鼠右侧大腿暴露坐骨神经，4-0铬制羊肠线结扎坐骨神经，假手术组只暴露坐骨神经而不结扎。从术后第2天开始，测量大鼠患侧后肢的机械性痛阈值(Paw Withdrawal Threshold，PWT)和热痛阈值(Paw WithdrawalLatency，PWL)，持续至造模后第21天。
　　2.神经痛大鼠脊髓脂氧素受体ALX细胞定位及表达变化
　　采用免疫荧光双标结合激光共聚焦方法，研究结果表明，与正常组、假手术组相比，模型组脊髓ALX免疫阳性细胞数量无显著差异;脊髓ALX免疫阳性物质大部分和星形胶质细胞共标，小部分与神经元共标，而与小胶质细胞不共标。
　　3.不同剂量ATL对神经痛大鼠机械痛行为变化的影响
　　大鼠随机分为CCI+ATL组、CCI+NS组、CCI+BOC-2组、CCI+BOC-2+ATL组、Sham+ATL组，Sham组，每组6只。在神经痛大鼠术后7天，单次鞘内给予不同剂量ATL50ng、100ng、200ng，观察ATL在神经痛大鼠的中枢镇痛作用;尾静脉单次给药ATL10ug/kg、40ug/kg，观察ATL的全身镇痛作用。
　　结论:模型大鼠出现患侧后肢机械痛阈和热痛阈降低的现象，证实神经痛大鼠模型制备成功。ATL通过与脊髓背角星形胶质细胞表面受体ALX结合，降低模型大鼠的脊髓神经炎症反应，提高机械痛阈。ATL可通过全身作用途径，减轻机械性痛觉超敏。
　　第二部分 JAK2-STAT3在神经痛及ATL抗炎镇痛的作用
　　1.ATL对神经痛大鼠脊髓p-STAT3及SOCS1-3表达变化的影响
　　将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、CCI+DMSO组，CCI+ATL组，术后第7天取材行Western-Blot、Real-Time PCR和免疫荧光结合激光共聚焦实验方法。结果显示，与正常组和假手术组相比，神经痛模型大鼠脊髓p-STAT3表达显著上调，SOCS2 mRNA、SOCS3 mRNA表达显著升高。与CCI+DMSO组相比，鞘内给予ATL200ng1h后可进一步显著上调SOCS3 mRNA的表达，对SOCS1 mRNA、SOCS2 mRNA的表达无显著影响;ATL在给药4h后显著下调脊髓p-STAT3的表达。
　　2.JAK2-STAT3信号通路在大鼠神经痛中的作用
　　2.1JAK2抑制剂AG490对神经痛大鼠机械痛行为变化的影响
　　大鼠随机分为正常组，CCI+DMSO组，CCI+AG490-1ug组，CCI+AG490-5ug组，每组10只。AG490组在造模前2小时及造模后第1天，第2天分别给予鞘内注射1ug，5ug AG490，共鞘内注射3次，并于造模后第2天，第4天，第7天观察机械痛行为的变化。
　　2.2AG490对神经痛大鼠脊髓炎性细胞因子表达变化的影响
　　实验大鼠分为正常组，CCI+DMSO组，CCI+AG490-5ug组，AG490组在造模前2小时及造模后第1天，第2天给予鞘内注射5ug AG490，共鞘内注射3次，并于造模后第7天新鲜取材检测脊髓炎性细胞因子的表达变化。Real-Time PCR实验结果表明，与CCI+DMSO组比较，鞘内注射AG490-5ug可显著降低脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的水平。
　　结论:脊髓JAK2-STAT3-SOCS信号通路参与神经痛的发生发展，ATL可通过调节脊髓p-STAT3表达变化而发挥抗炎镇痛作用。
　　第三部分 电针对神经痛大鼠抗炎镇痛的脊髓分子机制
　　1.电针对不同时程神经痛大鼠的行为学及分子机制
　　1.1电针对不同时程神经痛大鼠的机械痛及热痛行为学的影响
　　大鼠随机分为CCI组，CCI+EA组和CCI+SEA组，每组6只。采用Von-Freyhairs（弗莱毛测痛法）和热辐射测痛仪，检测神经痛大鼠患侧（右侧）足底机械痛阈(PWT)和热痛阈(PWL)变化。将实验大鼠按神经痛不同时程（术后3、7、21日，即POD3、POD7、POD21）分为3批进行电针干预实验。
　　研究结果提示，单次电针30min对不同时程(POD3、POD7、POD21)神经痛大鼠的痛行为（热痛、机械痛）均有明显改善作用，可在电针后30min、45min、60 min、90min不同时间点发挥镇痛作用，其中在改善机械痛、热痛行为学方面，以电针后60min较为显著。
　　1.2电针对不同时程神经痛大鼠脊髓5-LO及Annexin A1的影响
　　采用Real-Time PCR方法，检测单次电针对不同时程神经痛大鼠脊髓5-LOmRNA和AnnexinA1 mRNA水平变化的影响。研究结果显示，在术后第3天，单次电针可提高神经痛大鼠的脊髓5-LOmRNA水平（**P＜0.01），而对AnnexinA1mRNA变化不影响;在术后第7天，单次电针可提高AnnexinA1 mRNA水平，而对5-LO mRNA不影响;在术后第21天，单次电针均可提高AnnexinA1 mRNA和5-LO mRNA水平。
　　2.神经痛大鼠脊髓脂氧素受体ALX在电针镇痛中的作用
　　2.1ALX拮抗剂BOC-2对电针镇痛时机械痛行为变化的影响
　　将大鼠随机分为CCI组、CCI+Sham-EA组，CCI+EA组，CCI+EA+BOC-2组，观察电针及鞘内注射BOC-2对神经痛大鼠机械痛行为的影响。与假电针组相比，神经痛大鼠经单次电针或多次电针干预后，均可显著提高机械痛阈，而电针的即刻和累积镇痛效应均可被单次或多次鞘内注射的BOC-2逆转，而神经痛大鼠单纯鞘内注射BOC-2并未影响机械痛阈。
　　2.2BOC-2对电针镇痛时脊髓炎性细胞因子表达变化的影响
　　将大鼠随机分为CCI组、CCI+MEA组和CCI+MEA+BOC-2组，观察多次电针及鞘内注射BOC-2对神经痛大鼠脊髓炎性细胞因子表达的影响。与模型组相比，多次电针可显著降低神经痛大鼠脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的水平，而脊髓鞘内注射BOC-2可逆转多次电针的抗神经炎症效果。
　　结论:电针可能通过上调5-LO mRNA和AnnexinA1 mRNA表达，增加神经痛大鼠体内ALX配体物质的生成，部分通过ALX信号通路，下调脊髓炎性细胞因子表达，提高神经痛大鼠的机械痛阈。
　　综上所述，本工作提示:
　　1.脂氧素受体ALX主要表达于脊髓背角星形胶质细胞。脂氧素类似物ATL与细胞表面受体ALX特异性结合，抑制脊髓的神经炎症过程，减轻神经痛大鼠的机械痛觉超敏。ATL在静脉给药后也发挥全身抗炎镇痛的作用。
　　2.在神经痛过程中，脊髓p-STAT3，SOCS2 mRNA，SOCS3 mRNA表达上调，抑制JAK2可减轻神经痛大鼠的机械性痛觉超敏，缓解脊髓的神经炎症反应，鞘内注射ATL可降低p-STAT3表达，提高SOCS3 mRNA表达，提示脊髓JAK2-STAT3-SOCS3信号通路参与神经痛的过程。
　　3.电针可提高神经痛大鼠的机械痛阈和热痛阈，并提高脊髓5-LO和AnnexinA1 mRNA水平的表达，鞘内注射BOC-2可拮抗电针的镇痛作用，以上结果提示，电针可能通过提高神经痛大鼠体内ALX配体物质含量，与ALX特异性结合后，降低脊髓炎性细胞因子的表达，发挥抗炎镇痛的作用。

目录

英文缩写词表

摘要

前言

材料与方法

1．实验材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂及药品

1．3 主要仪器

2．实验方法

2．1 神经痛模型制备与评价

2．2 电针穴位和方法

2．3 给药途径和方法

2．4 组织切片的制备

2．5 免疫荧光组织化学

2．6 Western Blot

2．7 Real-Time PCR

2．8 数据统计和分析

2．9 有关溶液配制

实验结果

第一部分 脂氧素类似物ATL对神经痛大鼠机械痛行为及脊髓炎性细胞因子表达变化的影响

1．神经痛大鼠的机械性痛觉超敏及热痛觉过敏行为学变化

2．神经痛大鼠脊髓脂氧素受体细胞定位及表达变化

3．不同剂量ATL对神经痛大鼠机械痛行为的影响

4．ATL对神经痛大鼠脊髓炎性细胞因子表达变化的影响

第二部分 JAK2-STAT3在神经痛及ATL抗炎镇痛的作用

1．ATL对神经痛大鼠脊髓p-STAT3及SOCS1-3表达变化的影响

2．JAK2-STAT3信号通路在神经痛大鼠中的作用

第三部分 电针对神经痛大鼠抗炎镇痛的脊髓分子机制

1．电针对不同时程神经痛大鼠的行为学及分子机制

2．神经痛大鼠脊髓脂氧素受体ALX在电针镇痛中的作用

讨论

总结

参考文献

在读期间发表论文

参加学术会议

致谢

综述一 Resolvins抗炎镇痛研究进展

综述二 电针镇痛脊髓中枢机制的实验研究进展

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