石杉碱甲对D-半乳糖衰老大鼠肝脏细胞凋亡与自体吞噬的作用机制研究

摘要

[背景]
　　随着人们生活水平的提高，人口老龄化逐渐加速，已成为当今社会面临的重要挑战。因此，对衰老机制及衰老相关疾病的研究越发重要，近年来得到广泛的重视和关注。目前衰老的确切机制尚不清楚。D-半乳糖可诱导机体氧化应激损伤，模拟自然衰老进程，是目前衰老研究常用的动物模型。石杉碱甲是一种可逆的、选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)，目前国内临床广泛应用于神经退行性疾病的治疗，如阿尔茨海默病。然而，关于石杉碱甲能否改善D-半乳糖所致的肝脏衰老及其在衰老肝脏细胞凋亡与自体吞噬中的作用，目前尚未见研究。血管内皮生长因子(VEGF)是机体重要的细胞因子，可通过血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2/Flk-1)，调节下游的PI3K/Akt/GSK-3β信号通路，参与细胞凋亡的调控。同时，PI3K/Akt/mTOR信号通路与自体吞噬密切相关，GSK-3β亦可参与调节mTOR活性。细胞凋亡与自体吞噬两条信号通路可被这些共同的因子调控，这使两者之间存在密切联系。因此，我们设想:石杉碱甲能通过Flk-1调节下游的PI3K/Akt/GSK-3β/mTOR信号通路，参与调节D-半乳糖大鼠肝脏的细胞凋亡与自体吞噬，进而保护肝脏，延缓衰老。
　　[目的]
　　1.建立D-半乳糖大鼠衰老模型，通过血清肝功能、肝脏免疫组织化学染色及电镜检测，评估D-半乳糖能否诱导肝脏损伤及衰老。在此基础上，进一步探讨石杉碱甲对D-半乳糖所致肝脏损伤及衰老的作用。
　　2.比较各组肝脏凋亡指数(AI)及caspase3表达，探讨石杉碱甲对衰老大鼠肝脏细胞凋亡的影响。同时比较各组肝脏Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R、p-GSK-3β(Ser9)表达水平，进一步探讨石杉碱甲能否通过Flk-1/Akt/GSK-3β信号通路调节肝脏细胞凋亡。
　　3.比较各组肝脏p-mTOR(S2448)、LC3B、Atg7的表达，探讨石杉碱甲对衰老大鼠肝脏自体吞噬的影响。综合分析肝脏p-GSK-3β(Ser9)、p-mTOR(S2448)表达情况，进一步探讨石杉碱甲对衰老肝脏自体吞噬调节的可能机制。
　　[方法]
　　1.2月龄清洁级雄性Sprague Dawley大鼠36只，按随机数字表法平均分为三组:
　　(1)D-半乳糖组（D-半乳糖300mg/Kg/d皮下注射）;
　　(2)D-半乳糖+石杉碱甲组（D-半乳糖300mg/Kg/d+石杉碱甲0.1mg/Kg/d联合皮下注射）;
　　(3)对照组（生理盐水皮下注射）。每组各12只大鼠，实验时间持续8周。第8周末，每组各取3只大鼠，进行BrdU标记。
　　2.留取血清，全自动生化分析仪测定肝酶指标，评估肝功能。免疫组织化学染色测定肝脏SA-β-Gal、BrdU表达，比较三组肝脏衰老情况。电镜下观察三组肝脏细胞显微结构。
　　3.TUNEL染色检测肝脏细胞凋亡情况，计算三组AI，统计学比较差异。免疫组织化学染色测定肝脏Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R、p-GSK-3β(Ser9)表达，Western Blot分析测定肝脏caspase3表达，利用图像分析软件对结果进行半定量测定，三组计量数据进行统计学比较分析。
　　4.免疫组织化学染色测定肝脏p-mTOR(S2448)、LC3B、Atg7表达，Western Blot分析测定肝脏p-mTOR(S2448)表达，利用图像分析软件进行半定量分析，三组计量数据行统计学比较。
　　[结果]
　　1.2月龄雄性SD大鼠皮下注射D-半乳糖8周后，血清AST、TBIL、DBIL及ALP水平显著高于对照组(AST、DBIL:P＜0.01; TBIL、ALP:P＜0.001)。石杉碱甲可有效抑制D-半乳糖导致的AST、TBIL升高（P＜0.05），而对ALP、DBIL作用不明显。同时，与对照组相比，D-半乳糖+石杉碱甲组的AST、TBIL及ALP水平仍较高（AST、ALP:P＜0.05;TBIL:P＜0.01）。三组间ALT水平无明显差异（F=0.0227，P=0.978）。这提示，石杉碱甲可一定程度上减轻D-半乳糖所致肝损伤，但不能完全逆转。
　　2.免疫组织化学染色显示，与对照组相比，D-半乳糖组肝脏SA-β-Gal表达明显增加，BrdU阳性细胞显著减少。D-半乳糖+石杉碱甲组SA-β-Gal表达情况与对照组相似，较D-半乳糖组明显降低;BrdU阳性细胞较D-半乳糖组明显增多，但仍低于对照组。这说明，D-半乳糖可导致肝细胞衰老及复制能力降低，石杉碱甲干预可有效改善。
　　3.电镜显示，D-半乳糖组有大量脂滴沉积，线粒体肿胀、嵴减少，溶酶体内见脂褐素沉积，支持肝脏存在衰老相关变化。D-半乳糖+石杉碱甲组肿胀线粒体、脂滴明显减少，并见大量粗面内质网，提示石杉碱甲有助于清除受损线粒体及脂滴，促进细胞合成功能，延缓衰老。
　　4.TUNEL染色显示，D-半乳糖组见满视野凋亡细胞（核棕黄色、碎片、皱缩），石杉碱甲干预后凋亡细胞明显减少，对照组仅有少量凋亡细胞。D-半乳糖组AI(％)为73.150±2.635，明显高于对照组(2.117±0.651)及D-半乳糖+石杉碱甲组(13.884±1.547)，差异有统计学意义(P＜0.05)。D-半乳糖+石杉碱甲组AI仍高于对照组(P＜0.05)。Western Blot分析显示， D-半乳糖组肝脏caspase3表达明显高于对照组(P＜0.001)。石杉碱甲干预可有效抑制caspase3表达(P＜0.01)，但仍高于对照组(P＜0.01)。这说明，石杉碱甲可改善D-半乳糖所致的细胞凋亡，但尚不能完全逆转。
　　5.免疫组织化学染色显示，D-半乳糖+石杉碱甲组Flk-1(A-3)、p-Flk-1(tyr996)-R表达明显高于其他两组(P＜0.05)，而对照组与D-半乳糖组之间没有统计学差异(Flk-1(A-3): P=0.999;p-Flk-1(tyr996)-R: P=0.122)。 p-GSK-3β(Ser9)的表达在三组间有明显差异（ANOVA，F=1026.676，P＜0.001），其中以D-半乳糖+石杉碱甲组表达最高，对照组表达居中，D-半乳糖组表达最低（Holm-Sidak两两比较，P＜0.001）。这提示，石杉碱甲对衰老肝脏细胞凋亡的抑制，可能与Flk-1/Akt/GSK-3β信号通路的调节作用有关。
　　6.免疫组织化学染色显示，D-半乳糖组肝脏p-mTOR(S2448)表达明显高于对照组(P＜0.01);D-半乳糖+石杉碱甲组表达较D-半乳糖组明显下降（P＜0.05），与对照组相比无统计学差异(P=0.731)。三组LC3B表达有显著差异(ANOVA，F=38.4，P＜0.001)。D-半乳糖组LC3B表达低于对照组(P＜0.001)及D-半乳糖+石杉碱甲组(P＜0.01)，石杉碱甲干预可促进LC3B表达，但仍低于对照组(P＜0.01)。三组Atg7表达无统计学差异（ANOVA，F=2.747，P=0.117），但平均光密度值显示对照组Atg7表达相对最高，而D-半乳糖组最低。WesternBlot分析显示，D-半乳糖组肝脏p-mTOR(S2448)表达明显高于对照组(P＜0.001)。石杉碱甲干预可有效抑制p-mTOR(S2448)表达(P＜0.01)，但仍高于对照组（P＜0.01）。可见，D-半乳糖可抑制衰老肝脏的自体吞噬，石杉碱甲可一定程度上逆转该作用，促进自体吞噬。
　　7.综合分析三组肝脏p-GSK-3β(Ser9)及p-mTOR(S2448)表达情况，推断石杉碱甲对mTOR信号通路及自体吞噬的调节过程很复杂，不仅仅通过Flk-1/Akt/GSK-3β通路进行，可能与其他信号通路相关，且这些调节通路共同作用，最终表现为对自体吞噬的促进。
　　[结论]
　　1.D-半乳糖皮下注射SD大鼠8周，可诱导肝脏损伤、肝细胞衰老及复制能力降低。石杉碱甲干预可减轻D-半乳糖所致的肝脏损伤，延缓衰老。
　　2.D-半乳糖可促进衰老肝脏的细胞凋亡，石杉碱甲干预可有效改善细胞凋亡，但不能完全逆转。
　　3.石杉碱甲可能通过Flk-1/Akt/GSK-3β信号通路，参与调控衰老肝脏细胞凋亡。
　　4.D-半乳糖可抑制衰老肝脏的自体吞噬，石杉碱甲干预可一定程度上逆转该作用，促进自体吞噬。
　　5.石杉碱甲有助于清除衰老肝脏细胞内的受损线粒体及脂滴，促进细胞合成功能，这可能与其促进自体吞噬的作用有关。
　　6.石杉碱甲对mTOR信号通路及自体吞噬的调节过程很复杂，可能不仅仅通过Flk-1/Akt/GSK-3β通路进行，还与其他信号通路相关。

目录

英文缩写词索引

摘要

前言

第一部分 D-半乳糖大鼠衰老模型的建立

材料与方法

结果

讨论

第二部分 石杉碱甲与衰老肝脏细胞凋亡及自体吞噬关系的实验研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录一 综述 细胞凋亡、自体吞噬与衰老

附录二 硕士研究生在读期间发表论文

致谢

声明