华东部分地区W-北京基因型结核分枝杆菌传播特征研究

摘要

结核病是一种对人类健康和社会稳定造成严重威胁的传染病，中国是结核病高负担国家之一，尽管近些年来结核患病率有所下降，但我国的结核病疾病负担依然很严重。W-北京基因型结核分枝杆菌是一类由共同祖先进化而来、具有相似遗传背景的M.TB菌株，在世界各地均有不同水平的流行。W-北京家族菌株可能与结核耐药有关，能够引起暴发，形成流行优势。追踪传染源、阐明传播途径是结核病流行病学研究的两大问题，结核具有潜伏感染的特点，传统的流行病学方法并不能很好地阐述其传播机制，而以基因型分型技术为基础的结核分子流行病学在这方面有不可替代的优势。如与传统流行病学相结合，分子流行病学能更准确地预测疾病的流行、暴发，掌握其流行特征和传播模式。因此，本研究选取华东地区的阜宁县（江苏省）、德清县（江苏省）和鄞州区（浙江省）为研究现场，采用横断面调查和分子分型技术相结合的方法，描述华东地区W-北京基因型结核分枝杆菌的流行状况，分析影响W-北京株流行的社会人口学特征、临床治疗史、既往治疗史及人口流动等因素;确定菌株的VNTR-MIRU基因型，评估结核病的近期传播比例，探讨华东地区结核病的传播模式，为控制结核在人群中的传播提供线索;比较不同位点VNTR-MIRU的分型效果及应用前景，为完善结核分枝杆菌基因信息数据库提供资料。主要研究方法和结果如下:1、W-北京基因型结核分枝杆菌的流行及影响因素研究研究收集三个现场2009年6月/7月-2010年11月/12月在各区县疾控中心登记的痰培养阳性结核患者基本资料，收集患者的痰标本进行菌株培养、提取DNA，采用横断面研究结合DTM-PCR分型的方法，识别W-北京家族菌株及现代型W-北京株。研究共纳入346例结核患者的M.TB菌株，经RD105分型，90％ (311株)属于北京家族，阜宁、德清和鄞州的W-北京株检出比例分别为91％ (164株)、96％（23株）和87％（124株），差别没有统计学意义。W-北京株经RD181进一步分型，分别获得现代型W-北京株294株(77％)、古典型W-北京株90株(23％)。分析年龄、健康状况(BMI)等社会人口学因素及抗结核治疗史等临 床特征对W-北京家族株流行的影响，除鄞州地区男性比女性具有更高的感染风险(OR=3.415，95％CI: 1.071-10.884)外，未发现能够明显影响W-北京株流行的因素。2、结核分枝杆菌耐药基因型与传播关系采用直接测序法检测与异烟肼、利福平耐药有关的基因katG、rpoB。研究发现，309株获得katG基因的测序结果的M.TB菌株中，24株(7.77％)在katG基因315位存在突变，突变形式为AGC-ACC，其中23株属于W-北京家族菌株;有145株M.TB菌株获得rpoB基因测序结果，有7株(4.83％)发生531位突变，突变形式均为TCG-TTG，其中有6株(85.71％)为W-北京家族株。katG和rpoB基因在人群中的突变率差别没有统计学意义。仅有1株发生katG基因突变的M.TB菌株发生成簇，突变菌株的成簇比例为4％;发生rpoB基因突变的M.TB菌株的基因型均为“唯一”型，无菌株发生成簇。3、W-北京基因型结核分枝杆菌的基因型成簇特征及影响因素分析采用7位点VNTR-MIRU分型方法对成功获得DNA的426株M.TB菌株进行基因分型，识别了409种基因型，包括395种“唯一”基因型和14个簇（包括31株分离株），每个簇内有2-3株菌株不等，成簇比例为7.28％，近期传播比例为3.99％。阜宁有29株形成13个簇，成簇比例为15％;德清有2株形成1个簇，成簇比例为2％;鄞州无菌株成簇，均为“唯一型”;三地区成簇比例存在显著差异（x2=30.435，P＜0.001）。成簇菌株均为w-北京家族菌株，现代北京株的成簇率为7％，古典北京株成簇率为10％，二者的差别没有统计学意义，并且发现现代型与古典型菌株之间发生成簇。分析成簇患者的社会人口学及临床特征发现，户籍是影响M.TB菌株成簇的因素之一，流动人口的成簇风险明显低于本地人口(aOR=0.107，95％CI:0.013-0.856);未发现BCG接种史、结核治疗史及痰涂片结果对菌株成簇有影响。成簇患者中有6例为复治病人，均为其所在簇内最早出现结核症状的患者。在德清的成簇患者中，发现本地人口与流动人口之间存在近期传播。簇内各患者呈散在分布，相互间没有发现流行病学关联。4、VNTR-MIRU分型方法比较对阜宁地区199株M.TB菌株采用国际通用的15位点VNTR-MIRU进行基因分型，比较15位点与7位点VNTR-MIRU的分型能力。7位点组合中，各位点分辨力较高，最高为VNTR3820 (0.8597)，最低为Mtub21 (0.6050);而15位点组合中，各个VNTR-MIRU位点分辨力水平有较大差异，从0.0804(ETR C)到0.7753 (MIRU26)不等。15位点组合对阜宁地区M.TB菌株及北京株的总分辨力（HGI值）均为0.9994，而7位点组合的分辨力分别为0.9990和0.9988，略低于15位点组合。MIRU-15将阜宁199株M.TB菌株分为190种基因型，16株菌株成7个簇，成簇比例为8％，显著低于MIRU-7的成簇率(8％ vs.15％，x2=4.234，P=0.040)。位点联合使用可以提高VNTR-MIRU分型方法的分辨力，但过多增加位点数量并不能使总分辨力得到进一步提高。通过本研究，我们可以得出如下结论:1.W-北京家族菌株在华东地区的流行水平很高(90％)，且没有发现年龄、健康状况(BMI)、户籍等社会人口学因素与北京株的分布的关联，也没有发现BCG接种史、结核治疗史、痰涂片结果等临床特征与北京株的流行有关。2.W-北京株中，现代北京株的比例(77％)高于古典北京株，且现代北京株的分布不因社会人口学和临床特征而不同，始终占有较高的流行比例，提示现代型可能具有较强的致病性。3.研究地区M.TB菌株成簇比例较低，提示华东地区结核病的发生主要是由既往感染结核复发造成，存在较小比例的近期传播，而且未发现簇内患者之间存在流行病学关联，提示由偶然接触导致结核发生可能是华东地区结核病传播的主要模式。4.户籍是影响M.TB菌株成簇的主要因素之一，本地人口的成簇风险显著高于流动人口，提示本地人口比流动人口更容易发生结核的近期传播，同时研究也发现本地人口与流动人口之间能发生结核的交叉传播。5.推荐选择来自MIRU-7的VNTR3820、Qub11a、Qub18和来自MIRU-15的Qub11b、MIRU10、MIRU26、MIRU31位点进行华东地区M.TB菌株的基因分型研究。

目录

封面

常用缩略词

摘要

第一部分 研究背景

第二部分 研究设计

一、研究目标

二、研究现场

三、研究设计和资料收集

四、主要研究变量定义

五、实验方法

六、统计学分析

七、质量控制

第三部分 研究结果和讨论

第一节 W-北京基因型结核分枝杆菌的流行情况及影响因素研究

一、研究对象及方法

二、结果

三、讨论

第二节 W-北京基因型结核分枝杆菌的遗传多样性和成簇性分析

一、研究对象及方法

二、结果

三、讨论

第三节 W-北京基因型结核分枝杆菌的近期传播模式及危险因素研究

一、研究对象及方法

二、结果

三、讨论

第四节 VNTR-MIRU分型方法7位点与15位点分型效果比较

一、研究对象及方法

二、结果

三、讨论

第四部分 总结

参考文献

致谢

硕士期间撰写及参与撰写的文章

北京基因型结核分枝杆菌分子标志在结核病分子流行病学研究中的应用进展

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