低剂量微囊藻毒素对原代大鼠肝细胞促增殖效应的分子机制研究

摘要

随着水华污染的全球流行，人群暴露藻毒素的机会大大增高，对藻毒素的研究也受到越来越多的关注。微囊藻毒素(microcystin，MC)是由水体中的蓝藻产生的具有生物活性的单环7肽化合物，目前已发现了90余种MC的异构体。大量研究显示长期饮用低浓度MC污染的水与原发性肝癌、大肠癌和胃肠道肿瘤等肿瘤的高发率有关。MC生物毒性作用的靶器官为肝脏。已有的实验研究提示，MC的毒性效应表现为剂量上的双效性，即高剂量的MC能引起细胞程序性死亡或凋亡，而低剂量的MC则具有促进细胞增殖以及肿瘤形成的效应。由于MC对人群的危害更多地集中于通过饮水或饮食长期低剂量的暴露，且越来越多的流行病学资料显示其与肿瘤发生的相关性，因此，MC的慢性毒性尤其是潜在的致癌性成为研究的热点之一。多数动物实验研究显示，MC是肿瘤发生的促长剂而非引发剂，而失控的细胞增殖是在肿瘤形成过程中至关重要。因此，研究MC的促细胞增殖效应对于阐明MC的促癌作用机制具有重要意义。课题组前期研究发现1×10-5～1×10-6mol/L的MC-LR可引起细胞凋亡的发生;而1×10-9～1×10-12 mol/L的MC-LR则具有促细胞增殖的现象，表现为细胞活率增加、细胞周期中S期细胞比例增加，DNA合成速率增加。基于此，本课题继续采用原代大鼠肝脏细胞为研究模型，深入对低剂量MC-LR的促细胞增殖效应进行研究，在更早更多的时间点观察MC促细胞增殖效应及可能的分子机制，从细胞生物学与分子生物学的角度探讨MC低剂量暴露下原代大鼠肝细胞细胞周期及周期调控蛋白的变化，分析与细胞增殖密切相关的MAPK信号通路改变，为阐明MC与肝癌高发之间的关系提供实验基础和理论依据。
　　研究发现以1×10-9～1×10-12mol/L的MC-LR染毒原代大鼠肝细胞可引起细胞增殖效应，细胞增殖效应在染毒12h即能被观察到且在1×10-11 mol/L组增殖效应明显，表现为细胞活率增加、细胞周期中S期细胞比例增加。进一步研究发现，细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E mRNA及蛋白水平在MC-LR染毒后(3h-6h)可观察到有增高表现，cyclin A在染毒后（6 h-12 h）mRNA及蛋白水平增高。MAPK家族的P44/42、JNK1/2、P38的磷酸化活性在MC-LR染毒后(3h-6h)可观察到有增高表现，MAPK下游转录因子AP-1亚基c-fos在mRNA、蛋白及其磷酸化状态三个层面活性均在MC-LR染毒后(3h-6h)观察到增高表现。c-fos蛋白及磷酸化状态高水平持续至12h，c-fos mRNA水平在12h呈下降趋势，24 h c-fos各指标回复对照组水平。c-jun三个层面高表达的效应持续存在于染毒后3h-24h。各分子效应最明显在1×10-10或1×10-11 mol/L剂量组，与细胞增殖效应在剂量组上重合，早于细胞增殖现象且在作用时间上相互呼应。实验结果提示细胞周期蛋白cyclin的高表达、MAPK家族蛋白磷酸化活性的增高、AP-1活性增强可能与MC-LR的促细胞增殖效应相关。

目录

主要缩略词表

摘要

前言

参考文献

第一部分 低剂量MC-LR促原代大鼠肝细胞增殖效应观察

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 低剂量MC-LR对原代大鼠肝细胞周期及周期蛋白的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 低剂量MC-LR对原代大鼠肝细胞MAPK信号通路的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

致谢

细胞周期相关蛋白与肿瘤研究进展

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