DIXDC1基因在胃癌侵袭转移中的作用及相关机制研究

摘要

胃癌仍是我国的第二大肿瘤。大部分患者确诊时已达中晚期。而局部复发和转移是胃癌死亡率较高的主要原因。随着分子生物学的迅猛发展，许多研究致力于寻找肿瘤侵袭转移过程中的关键分子，并通过干预这些分子控制肿瘤的转移。
　　DIXDC1是以Wnt通路核心分子Axin2的C-末端为诱饵，通过酵母双杂交实验筛选出的与Axin2 C-末端相互作用的一个蛋白;是Wnt通路的正调控因子Ccdl(Coiled-coil-DIX1)基因人类的异构体。研究显示DIXDC1属于actin和tubulin等细胞骨架蛋白家族，可能参与细胞形态和运动的调节。而在肿瘤中关于DIXDC1的报道较少，课题组前期的工作证实其可以通过上调cyclin D1、下调p21表达促进大肠癌细胞周期G0/G1到S期的转化，从而促进大肠癌细胞的增殖和肿瘤的形成，同时PI3K信号通路参与其促大肠癌细胞增殖的过程。
　　目的:
　　研究DIXDC1在不同组织类型胃癌中的表达情况并分析其与临床病理参数的相关性;探索DIXDC1在胃癌侵袭和转移等恶性生物学行为中的作用及其初步的分子生物学机制。
　　方法:
　　免疫组织化学检测DIXDC1在胃癌石蜡组织标本中的表达;Western Blot检测多种胃癌细胞系中DIXDC1的表达;建立DIXDC1过表达质粒，并包装慢病毒载体，对低表达DIXDC1的胃癌细胞系进行感染，建立稳定表达DIXDC1的胃癌细胞系;利用划痕实验、Transwell侵袭实验研究DIXDC1对胃癌迁移、侵袭能力的影响;Western Blot检测过表达DIXDC1后胃癌细胞中肿瘤侵袭转移相关蛋白变化;双荧光素酶报告实验验证DIXDC1对β-catenin/TCF转录活性的影响;免疫共沉淀明确DIXDC1与β-catenin相互作用关系;共聚焦显微镜观察DIXDC1和β-catenin在胃癌细胞中的亚细胞定位;Western Blot方法检测DIXDC1对β-catenin磷酸化及核蛋白表达的影响。
　　结果:
　　1、DIXDC1在胃癌组织中表达上调并且与胃癌TNM分期、淋巴结转移相关。利用免疫组织化学检测DIXDC1在在66例胃癌组织及28例上皮内瘤变组织中的表达，发现DIXDC1在胃癌组织中的阳性率为56.0％(37/66)，在上皮内瘤变组织中阳性率为28.6％(8/28)，而在正常胃组织中不表达。卡方分析显示DIXDC1的表达与胃癌临床分期、淋巴转移及组织学类型均相关。在94例胃癌及其癌前病变组织中，29.8％出现β-catenin在细胞核内表达，Spearman相关性分析显示DIXDC1的阳性表达与β-catenin在胃癌细胞中的核定位相关。
　　2、过表达DIXDC1基因可显著促进胃癌细胞的迁移与侵袭能力，干扰DIXDC1基因则抑制胃癌细胞迁移能力。
　　通过构建DIXDC1过表达慢病毒载体，感染胃癌细胞，成功建立了稳定高表达DIXDC1的胃癌细胞系BGC823-DIXDC1和阴性对照株BGC823-vector。划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验显示过表达DIXDC1基因后，BGC823细胞迁移和侵袭能力明显增高。设计合成DIXDC1干扰siRNA，并转染高表达DIXDC1的胃癌细胞株HGC27，Transwell迁移实验显示DIXDC1基因被干扰后HGC27细胞迁移能力明显下降。Western Blot检测显示DIXDC1过表达的胃癌细胞中，肿瘤侵袭转移相关蛋白MMP3、MMP7表达有所增高，而caveolin-1、E-cadherin蛋白表达下降。上述结果提示，DIXDC1基因可显著促进胃癌细胞的迁移与侵袭能力。
　　3、DIXDC1通过抑制激酶GSK-3β的活性，下调β-catenin蛋白的磷酸化水平，并促进β-catenin入核堆积，从而促进胃癌的侵袭转移。
　　双荧光素酶报告实验显示过表达DIXDC1可以增加β-caenin/TCF启动子转录活性，而免疫共沉淀发现DIXDC1与β-catenin在胃癌细胞内确实存在相互作用关系。过表达DIXDC1后，β-catenin蛋白磷酸化水平下降，而细胞中蛋白总量及核蛋白表达增加，免疫荧光进一步证实过表达DIXDC1后β-catenin在细胞核中表达增多。而过表达DIXDC1可影响磷酸化β-catenin的激酶GSK-3β的活性。提示DIXDC1可能通过调节激酶GSK-3β的活性，抑制其对β-catenin蛋白的磷酸化，并促进β-catenin入核堆积，从而促进胃癌的侵袭转移。
　　结论:
　　DIXDC1在胃癌组织中高表达，且与胃癌组织类型、淋巴结转移、肿瘤大小等临床病例指标相关;过表达DIXDC1基因可显著促进胃癌细胞的迁移与侵袭，干扰DIXDC1基因则抑制胃癌细胞迁移能力;DIXDC1通过抑制激酶GSK-3β的活性，下调β-catenin蛋白的磷酸化水平，并促进β-catenin入核堆积，从而促进胃癌的侵袭转移。

目录

英文缩略语注释

摘要

前言

第一部分 DIXDC1和β-catenin在胃癌组织中的表达

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 DIXDC1对胃癌细胞迁移侵袭的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 DIXDC1影响胃癌的迁移侵袭机制初步探讨

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述 经典Wnt信号传导通路对胃癌发生发展的影响

致谢

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