红花黄色素A的提取分离及其对神经细胞损伤保护作用研究

摘要

红花，为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥管状花，是一种传统的中草药。现代药理研究表明红花中水溶性的红花黄色素是红花的主要有效成分，呈现出多种药理活性，红花黄色素是含有多种成分的混合物，红花黄色素A（Saffloweryellow A，SYA）是重要的活性成分之一。
　　本文以红花为原料，采用水渗漉和多步柱层析法分离纯化获得红花黄色素A（SYA）并确证了结构；体外培养人神经母细胞瘤株（SH-SY5Y）和原代培养的大鼠海马神经元细胞，分别采用谷氨酸（Glutamic acid，Glu）进行外源性损伤，探究红花黄色素A对谷氨酸损伤的SH-SY5Y细胞和大鼠海马神经元细胞的保护作用并从分子水平验证其保护机制。为开发具有神经细胞保护、拮抗损伤凋亡作用的新药，提供了丰富的理论依据。主要研究内容及结果如下：
　　（1）红花药材去离子水渗漉，浓缩渗漉液，醇沉除杂，浓缩液经AB-8大孔吸附树脂柱层析得到红花黄色素A粗品，再经过葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）柱层析得到红花黄色素A纯品。
　　（2）新生大鼠海马神经元细胞原代培养方法的建立，采用无血清培养方法，两天半量换液并采用甲苯胺蓝染色法对海马神经元进行鉴定。根据文献确定了SH-SY5Y细胞培养方法。
　　（3）采用谷氨酸建立细胞损伤模型，MTT比色法测定细胞活力并确定谷氨酸最佳造模浓度，最终确定SH-SY5Y以2mM的谷氨酸终浓度损伤24h，在实验条件下细胞的损伤率为30％；大鼠海马神经元细胞以100uM的谷氨酸浓度损伤24h。
　　（4）倒置相差显微镜下观察可见，正常状态下的SH-SY5Y细胞呈梭形或三角形，有明显突触，细胞饱满，立体感强；使用浓度为2mM的Glu作用24h后，可见明显损伤，镜下可观察到细胞的突起消失，肿胀圆缩，立体感差，折光性下降，贴壁能力下降，细胞聚集，部分细胞裂解成碎片；红花黄色素A给药组与模型组相比，低浓度SYA（5μg/mL）可以减轻谷氨酸对SH-SY5Y细胞的损伤；高浓度SYA（10μg/mL）能明显减轻 Glu对 SH-SY5Y细胞形态的影响，表现为细胞折光性较好，细胞碎片形成减少，细胞聚集减少。
　　原代培养48h的神经元细胞可见细胞分散均匀，胞体呈三角形或多边形，饱满立体感强，部分细胞伸出较短的突触；培养至第七天的神经元细胞树突轴突明显并连成网状结构；100μM浓度的Glu作用24h后，可观察到细胞明显损伤，大部分细胞皱缩，突起消失，胞体立体感差，可见较多凋亡细胞；红花黄色素A保护组细胞生长状态良好，细胞间仍保持良好的突起联系，较少出现细胞皱缩的现象。
　　（5）MTT比色法结果显示，红花黄色素A预处理两小时，共孵育24h，与模型组相比，红花黄色素A两个浓度组对谷氨酸损伤均呈现出一定的保护作用；细胞形态学结果显示，红花黄色素A给药组的细胞损伤程度较弱。
　　（6）免疫荧光组化分析不同实验组细胞内Bcl-2，Bax蛋白的表达，Westem-blot法检测不同实验组细胞内凋亡相关蛋白 Bcl-2与 Bax的表达水平及活性部分Caspase-3及Caspase-9含量变化。结果表明与正常组相比Glu损伤组细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平明显降低而红花黄色素A（10μg/mL）给药组能够维持较高的Bcl-2表达水平。与正常组相比Glu损伤组细胞中促凋亡蛋白Bax表达水平明显升高，红花黄色素A（10μg/mL）给药组能够在一定程度上抑制Bax的表达。Glu能够诱导活性Caspase-9和Caspase-3含量显著升高而红花黄色素A能够通过抑制Caspase-9和Caspase-3的活性含量对从而对Glu氧化性神经损伤起保护作用。

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主要符号表

1 文献综述

1.1 红花的化学成分研究

1.2 红花黄色素提取纯化方法的研究

1.3 红花黄色素的药理活性研究

1.4 谷氨酸的神经毒性研究

1.5 天然药物神经保护作用的研究

1.6 研究的内容、目的及意义

2 红花黄色素A的分离与纯化

2.1 实验材料与仪器

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

3 SYA对谷氨酸损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验数据处理

3.4 实验结果

3.5 讨论

3.6 小结

4 SYA抑制谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的分子机制研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验数据处理

4.4 实验结果

4.5 讨论

4.6 小结

5 SYA抑制谷氨酸诱导的海马神经元细胞凋亡的分子机制研究

5.1 实验材料

5.2 试验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

5.5 小结

6 结论

7 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文