腺苷诱导肝癌BEL-7404细胞凋亡的分子机制研究

摘要

背景：
　　腺苷全称腺嘌呤核苷，是一种广泛存在于细胞内外的重要信号分子，参与调节细胞的多种生理生化功能，在循环和神经系统中发挥着重要的作用。前期研究发现细胞外的腺苷具有细胞毒作用，它可通过腺苷受体或腺苷转运体激活多种死亡途径诱导肿瘤细胞发生凋亡，因此近年来已成为抗肿瘤药物研发的热点。线粒体是生物能量代谢和发生氧化磷酸化的主要场所，是细胞中产生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的一个重要部位，越来越多的研究显示线粒体在介导细胞凋亡的过程中发挥了极为重要的作用。
　　我们前期研究发现腺苷可通过激活Caspase-8/9/3诱导肝癌Huh-7、HepG2细胞发生Caspase依赖的凋亡;此外，腺苷还可通过上调AMID表达，促AMID从胞浆入核，诱导肝癌Huh-7细胞发生非Caspase依赖的凋亡。另有研究报道，一些化疗药物可通过增加细胞内ROS水平诱导细胞凋亡。然而，腺苷是否通过线粒体途径诱导肝癌细胞凋亡以及ROS是否参与介导腺苷诱导的细胞凋亡目前仍未见报道。
　　目的：
　　探讨腺苷在肝癌研究中的意义，明确腺苷是否能够通过线粒体依赖的途径介导肝癌细胞凋亡，以及ROS在腺苷诱导的肿瘤细胞凋亡中的作用，以期阐明腺苷抗肿瘤的新机制。
　　方法：
　　1.通过CCK-8细胞活性检测及结晶紫染色的方法检测腺苷对肝癌BEL-7404细胞增殖的影响。2.用流式细胞仪检测腺苷对BEL-7404细胞周期的影响。3.运用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡的发生。4.利用Western blot、线粒体膜电位检测、细胞线粒体分离等一系列实验技术探寻腺苷诱导肝癌BEL-7404细胞凋亡的分子机制。5.通过流式细胞术检测胞内ROS水平。6.联合使用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)及腺苷处理细胞后检测细胞ROS水平、线粒体膜电位变化、细胞色素C(Cytochrome C，Cyto C)的释放以及细胞凋亡的发生。
　　结果：
　　1.腺苷能显著抑制肝癌BEL-7404细胞的增殖。2.腺苷能诱导BEL-7404细胞出现sub-G1期凋亡峰及发生明显的G2/M期阻滞。3.运用Annexin V/PI双染法证实腺苷能够诱导BEL-7404细胞发生凋亡且以晚期凋亡为主。4.研究发现腺苷上调促凋亡蛋白Bak，下调抑凋亡蛋白Bcl-xl和Mcl-1的表达，使线粒体膜电位下降，线粒体间隙蛋白（SMAC/DIABLO，Cyto C，凋亡诱导因子(Apoptosisinducing afctor, AIF)）释放入胞浆，通过不同信号转导途径，激活Caspase级联反应，导致细胞凋亡。5.腺苷能显著增加BEL-7404细胞内的ROS水平，呈剂量和时间依赖性。6.抑制ROS的生成可以逆转腺苷诱导的线粒体膜电位下降、CytoC的释放以及细胞晚期凋亡。
　　结论：
　　研究证实，腺苷通过诱导肝癌BEL-7404细胞凋亡抑制其增殖;发现腺苷通过线粒体途径及死亡受体途径诱导肝癌BEL-7404细胞凋亡;首次阐明腺苷通过ROS介导的线粒体功能障碍促肿瘤细胞凋亡的新机制。为腺苷应用于肝癌治疗以及肿瘤靶向药物的研发提供了新的依据。

目录

英文缩略词

摘要

第一章 引言

1．1 腺苷的代谢及生理学效应

1．2 腺苷对肿瘤细胞增殖的调控

1．3 腺苷在肝癌研究中的意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

第三章 实验结果与分析

3．1 腺苷显著抑制肝癌BEL-7404细胞增殖

3．2 腺苷对肝癌BEL-7404细胞形态的影响

3．3 腺苷诱导肝癌BEL-7404细胞发生凋亡

3．4 腺苷引起BEL-7404细胞线粒体功能障碍诱导细胞凋亡

3．5 腺苷使BEL-7404细胞内ROS水平升高致线粒体功能障碍

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

腺苷受体——肿瘤治疗的新靶点

在读期间发表的论文

致谢

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