声带白斑临床分型及半乳糖凝集素-3在声带白斑中表达的作用研究

摘要

目的:
　　(1)比较声带白斑喉镜分型对应的病理诊断，探索声带白斑喉镜下分型与病理的关系，观察部分声带白斑患者转归情况，为指导声带白斑患者选择合适的治疗及手术方案提供参考;(2)验证半乳糖凝集素3(Galectin-3)及自噬相关因子在声带白斑中的表达，分析其在不同类别声带白斑中的表达的意义及可能机制，为下一步实验研究做好准备工作。
　　方法:
　　回顾性分析2003年1月至2014年3月就诊于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科因声带白斑住院治疗的患者资料。并对声带白斑进行分型:平坦光滑型（Ⅰ型），隆起光滑型（Ⅱ型），肥厚粗糙型（Ⅲ型）;根据患者术后病理分组为:无不典型增生组（A组），轻度不典型增生组（B组），中度不典型增生组(C组)，重度不典型增生组（D组）和癌变组（E组）。统计各组声带数量，分析各型各组特点。随访观察平坦光滑型声带白斑的转归。
　　收集2012年4月25日至2013年9月26日就诊于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院患者，包括声带息肉、声带白斑，怀疑为喉癌者行活检的标本，进行Real-time PCR、Western blot、免疫组化、电镜检测，观察Galectin-3及自噬相关因子基因、蛋白水平的表达情况及表达位置、是否存在自噬体。
　　结果:
　　1170例声带白斑患者，共1635侧声带，其中402侧(24.6％)声带白斑为平坦光滑型（Ⅰ型），609侧(37.2％)声带白斑为隆起光滑型（Ⅱ型），624侧(38.2％)声带白斑为肥厚粗糙型（Ⅲ型）。
　　在402侧平坦光滑型（Ⅰ型）声带白斑中，无不典型增生组占该组声带数的比例最高，为76.9％，是隆起光滑型无不典型增生声带白斑217侧(35.6％)的2.2倍，是肥厚粗糙型无不典型增生声带白斑的2.6倍。其次为轻度不典型增生组51侧(12.7％)声带;中度不典型增生组(2.7％)、重度不典型增生组(3.9％)和癌变组(3.7％)的比例均较低。
　　在609侧隆起光滑型（Ⅱ型）声带白斑中，无不典型增生组35.6％的比例较Ⅰ型组中对应的病理各组的比例明显下降;轻度不典型增生组占35.5％、中度不典型增生组为9.7％;重度不典型增生组(8.4％)和癌变组(10.8％)的比例明显增高。
　　624侧为肥厚粗糙型（Ⅲ型）声带白斑中，无不典型增生、轻度不典型增生和中度不典型增生的比例分别为13.8％、25.3％和10.1％;重度不典型增生组(21.5％)和癌变组(29.3％)的比例最高。肥厚粗糙型（Ⅲ型）声带白斑的重度不典型增生（D组）比例是隆起光滑型(Ⅱ型)重度不典型增生（D组）声带白斑的2.6倍，是平坦光滑型（Ⅰ型）重度不典型增生（D组）声带白斑的5.5倍。肥厚粗糙型（Ⅲ型）声带白斑的癌变（E组）比例是隆起光滑型（Ⅱ组）癌变(E组)比例的2.7倍，是平坦光滑型（Ⅰ型）癌变（E组）比例的7.9倍。卡方检验比较不同喉镜分型中不同病理结果的声带数，差异有统计学意义，x2=410.1，p=0.000。
　　行病因治疗和中成药治疗的162例光滑平坦型声带白斑患者，总随访时间为160天（5.3月）至3519天（9.6年），随访中位数904天（2.5年）。其中，100例(61.7％)治愈;48例(29.6％)声带白斑持续存在;11例(6.8％)声带白斑复发;3例(1.9％)声带白斑在保守治疗期间加重。
　　定量PCR验证galectin-3在声带息肉、声带白斑、喉癌组织中的表达情况，表达量分别为3.28、2.24、0.49。统计学比较三者的差异，差异均有统计学意义:t息肉、白斑=2.06，p息肉、白斑=0.05;t息肉、喉癌=4.78，p息肉、喉癌=0.00;t白斑、喉癌=4.47，p白斑、喉癌=0.00。验证自噬相关分子lc3b、beclin-1在声带息肉、声带白斑、喉癌中的表达情况，lc3b的表达量分别为1.39、2.28、1.06;beclin-1的表达量分别为1.86、2.67、1.14。统计学比较三者的差异，差异均无统计学意义:tlc3b息肉、白斑=0.74，plc3b息肉、白斑=0.46;tlc3b息肉、喉癌=0.46，plc3b息肉、喉癌=0.65;tlc3b白斑、喉癌=0.65，plc3b白斑、喉癌=0.52;tceclin-1息肉、白斑=0.83, pbeclin-1息肉、白斑=0.41;tbeclin1息肉、喉癌=0.87，pbeclin-1息肉、喉癌=0.39;tbeclin-1白斑、喉癌=1.03，pbeclin-1白斑、喉癌=0.31。
　　分析基因水平galectin-3、lc3b、beclin-1在声带白斑组织有无不典型增生及各类不典型增生情况、有无癌变的表达差异，统计学比较后部分结果有统计学意义。
　　在白斑组织的验证结果中，用定量PCR的结果计算galectin-3与beclin-1的相关系数，r=0.36，p=0.02，可以认为两者相关;计算galectin-3与lc3b的相关系数，r=0.08，p=0.62，两者无相关性。
　　Western Blot验证GALECTIN-3在声带息肉、声带白斑、喉癌组织中的表达情况，GALECTIN-3的表达量分别为2.30、2.58、1.31，统计学比较三者的差异:t息肉、白斑=0.39，p息肉、白斑=0.70;t息肉、喉癌=2.03，p息肉、喉癌=0.05;t白斑、喉癌=2.57，p白斑、喉癌=0.01，声带白斑与喉癌的表达差异有统计学意义。
　　Western Blot验证自噬相关分子BECLIN-1在声带息肉、声带白斑、喉癌中的表达情况，表达量分别为1.81、1.71、0.55，统计学比较后发现在声带白斑和喉癌中的差异有统计学意义:tbeclin-1息肉、白斑=0.16，pbeclin-1息肉、白斑=0.87;tbeclin-1息肉、喉癌=2.40，pbeclin-1息肉、喉癌=0.03; tbeclin-1白斑、喉癌=2.92，pbeclin-1白斑、喉癌=0.01。
　　分析蛋白水平GALECTIN-3、BECLIN-1在声带白斑组织有无不典型增生及各类不典型增生情况、有无癌变的表达差异，统计学比较后部分结果有统计学意义。
　　使用Western Blot的结果计算所有白斑组织中，Galectin-3与Beclin-1的相关系数，r=0.60，p=0.00，可以认为两者的表达量具有相关性。
　　免疫组化染色显示Galectin-3主要表达在细胞质和细胞膜上，Beclin-1、LC3B主要表达在细胞质中。透射电镜下声带白斑组织中存在自噬体。
　　结论:
　　光滑平坦型声带白斑，病理主要为无不典型增生和轻度不典型增生(89.6％)，其保守治疗治愈率高(61.7％)，且癌变率低(3.7％)，为白斑早期，宜先保守治疗。隆起光滑型（Ⅱ型）声带白斑病理仍以无不典型增生和轻度不典型增生为主(71.1％)，但癌变率较高(10.8％)，不宜保守治疗。肥厚粗糙型（Ⅲ型）声带白斑病理主要以中、重度不典型增生及白斑癌变为主(60.9％)，癌变率极高(29.3％)，为白斑晚期，建议应尽早手术治疗。
　　声带白斑组织中有自噬的发生，Galectin-3与自噬相关分子之一Beclin-1的表达量有一定相关性，其发生相互作用的位置可能在细胞质中。Galectin-3有可能作为判断声带白斑、喉癌发生的标志。

目录

摘要

引言

第一部分 1170例声带白斑喉镜图像分型与病理分析研究

1．1 材料与方法

1．1．1 临床数据

1．1．2 研究过程

1．1．3 统计分析

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 结论

参考文献

第二部分 平坦光滑型声带白斑临床观察

1．1 对象和方法

1．1．1 研究对象

1．1．2 研究方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 结论

参考文献

第三部分 半乳糖凝集素-3在声带白斑中的表达及可能机制

1．1 对象和方法

1．1．1 研究对象

1．1．2 主要仪器

1．1．3 主要试剂

1．1．4 实验方法

1．2 实验结果

1．2．1 普通PCR

1．2．2 Real-time PCR结果

1．2．3 Western Blot

1．2．4 免疫组化

1．2．5 透射电镜

1．3 讨论

1．4 结论

1．5 本研究不足之处

参考文献

附 大鼠黏膜不典型增生及癌变动物模型的建立

综述 声带白斑研究进展

本论文的不足之处

在学期间发表论文和参加科研情况

致谢

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