胚胎干细胞诱导分化为大脑皮质谷氨酸能神经元的实验研究

摘要

目的:谷氨酸能神经元作为中枢神经系统中最重要的兴奋性神经元，调节着释放进入突触间隙谷氨酸递质的量，参与了几乎所有脑的功能。它的异常和丢失会导致兴奋性神经递质谷氨酸的异常，从而诱发多种神经系统疾病，诸如阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、精神分裂症、抑郁症、癫痫、耳聋发病等。而胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)以其可体外无限增殖和全能性等生物学特性，有望为神经系统疾病细胞替代性治疗提供细胞来源。以往的研究都集中于胚胎干细胞经外部因素的诱导而转化为神经元细胞，不仅方法过于复杂，而且诱导效率也较低，因此本论文拟开展研究一种新的胚胎干细胞神经分化的诱导方法。
　　方法:1.分离BALB/c小鼠囊胚内细胞团(Inner cell mass，ICM)，放置于饲养层细胞上生长，制备小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic stem cells，mESCs)，培养传代并鉴定后，冻存备用。2.利用优化的无血清悬浮培养法诱导mESCs向端脑前体细胞选择分化，并用流式细胞仪检测Bf1+和Emx1+端脑皮质前体细胞的比例。3.PCR扩增不同分化阶段细胞标志基因胚胎干细胞关键蛋白(0ct3/4)、巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(Tuj1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的cDNA，琼脂糖凝胶电泳检测其含量。4.环巴胺诱导端脑前体细胞选择分化为VGLUT1+谷氨酸能神经元。5.免疫荧光染色优化法诱导所得细胞的谷氨酸能神经元标记Tuj1+和VGlUT1+。6.膜片钳记录检测体内、外VGLUT1+神经元电生理特性。
　　结果:1）该法可使mESCs自主发生神经细胞分化，主要依赖细胞的内部机制和弱的内源性细胞外信号。2）此种诱导技术能使mESCs高效分化为Bf1+端脑前体细胞，达总细胞量的70％，其中89％细胞表达皮质标记物Emx1。3）该法能使mESCs按照一个先神经元-后胶质细胞的顺序有效分化，与体内胚胎神经组织发育先后顺序一致。4）环巴胺能提高生成VGLUT1+谷氨酸能神经元的比例，达总细胞量的70％。5)该法诱导所得的端脑前体细胞可分化为有功能的皮质谷氨酸能神经元。
　　结论:通过优化无血清悬浮培养技术，我们成功建立了一种高效诱导胚胎干细胞分化为大脑皮质谷氨酸能神经元的技术，这不仅为治疗和研究神经组织退化性疾病或脑损伤性疾病提供了潜在的细胞来源，而且对于了解神经组织的发育机制也具有一定的科学意义。

目录

主要英文缩略词表

摘要

前言

(一)材料与方法

1 材料

1．1 主要试剂

1．2 主要动物

1．3 主要仪器

1．4 主要溶液配制

2 方法

2．1 PMEF细胞的分离培养

2．2 饲养层的制备

2．3 囊胚的获得和培养

2．4 内细胞团(ICM)的分离

2．5 mESCs的消化和培养

2．6 mESCs的AKP染色

2．7 mESCs的表面抗原SSEA-1鉴定

2．8 优化SFEB培养法

2．9 细胞标志性基因表达检测

2．10 免疫荧光染色定向分化的神经细胞

2．11 流式细胞术分选目的细胞

2．12 膜片钳技术检测VGLUT1+细胞的电生理特性

2．13 VGLUT1+谷氨酸能神经元细胞移植

2．14 荧光镜检VGLUT1+细胞在脑内的位置

2．15 膜片钳技术检测VGLUT1+细胞在小鼠脑内的电生理特性

2．16 统计学方法

(二)结果

1．小鼠胚胎干细胞的分离培养和鉴定结果

2．优化SFEB培养法：高效诱导鼠ESCs向端脑皮质神经前体细胞分化

3．优化SFEB法诱导的端脑前体细胞能生成皮质谷氨酸能神经元

4．优化法生成的VGLUT1+细胞具有类似成熟神经元的电生理特性

5．体内移植后的VGLUT1+神经元具有谷氨酸能神经元的电生理特性

(三)讨论

结论与展望

参考文献

综述一 体外诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法进展

综述二 体外三维培养胚胎干细胞形成脑垂体和视杯样器官

硕士研究生期间发表论文情况

致谢

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