枯草芽孢杆菌发酵法生产N-乙酰神经氨酸的研究

摘要

唾液酸(sialic acid,SA)，学名N-乙酰神经氨酸（N-acytl-neuraminic Acid,简称NeuAc或Neu5Ac），是一类含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖的总称，是天然存在的碳水化合物，并于上世纪50年代首次得到分离纯化同时进行了结构的确定。Neu5Ac在生命代谢活动调节的过程中起着重要作用，它广泛地分布于多种生物组织中，通常位于非还原性寡聚糖的末端。Neu5Ac具有包括抗老年痴呆、抗识别、提高肠道对维生素和矿物质的吸收以及提高婴儿的智力和记忆力，抗菌排毒和抗病毒等生理功能，目前已经在多个领域得到了应用。
　　枯草杆菌由于其GRAs（Generally Recognized as Safe）特性，在食品工业生产领域受到了广泛重视与应用。本课题相关人员尝试将重组质粒pHT01-neuBC转化到枯草芽孢杆菌B.subtilis168中并进行诱导表达，来构建一条发酵生产Neu5Ac的代谢通路，并取得了初步成功。但是在基因工程菌B.subtilis168/pHT01-neuBC发酵生产Neu5Ac过程中发现，枯草芽孢杆菌在发酵中后期容易形成休眠体——芽孢，并且该外源重组质粒在宿主细胞内不能稳定遗传，高达72％的质粒会随着发酵过程中宿主细胞的生长分裂而丢失。据此推测以上两个原因是限制枯草芽孢杆菌发酵生产Neu5Ac性能的主要原因。
　　因此本论文所述课题主要涵盖了以下三部分的内容：第一，对枯草杆菌B.subtilis168进行芽孢敲除。发酵过程中芽孢休眠体的形成是影响枯草杆菌外源基因表达水平的直接因素。选定芽孢形成相关基因spo0A基因作为敲除对象，利用同源重组法对spo0A基因进行了无痕敲除，得到了无芽孢的枯草杆菌突变株B.subtilis168Δspo0A。第二，架构一条枯草杆菌从常见碳源到Neu5Ac的代谢通路。利用同源重组整合法,将N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC整合到枯草杆菌B.sububtilis168基因组上，首次获得了能够稳定表达外源基因neuBC并能够发酵生产Neu5Ac的工程菌B.subtilis168Δspo0A-neuBC。第三，通过对构建的工程菌株进行了培养基组分包括碳源、氮源的优化，进一步提高了N-乙酰神经氨酸的发酵产量，筛选了最佳发酵条件，明显提高了Neu5Ac的发酵产量。
　　对B.subtilis168进行芽孢敲除获得了枯草芽孢杆菌基因工程菌B.subtilis168Δspo0A，经过摇瓶培养及菌种OD600检测验证后发现无芽孢枯草杆菌比野生型菌株生长状况更好。野生型枯草杆菌B.subtilis168不具备生产Neu5Ac的能力。经过Neu5Ac代谢途径构建之后，对工程菌B.subtilis168Δspo0A-neuBC进行摇瓶发酵，成功得到了最大产量为0.397g·L-1的Neu5Ac，5L(装液量2L，37℃)发酵罐放大生产获得的最高产量为3.67g·L-1。通过对发酵条件的进一步优化获得了最佳发酵方案：酵母粉16g·L-1，山梨醇20g·L-1,硫酸铵4g·L-1,磷酸二氢钾5g·L-1,七水硫酸镁1g·L-1，维生素B0.4g·L-1，微量元素0.4g·L-1，在OD600=0.6时加入IPTG0.2mmol·L-1，发酵初始pH为自然pH。经过发酵优化使Neu5Ac的摇瓶发酵产量达到了0.46g·L-1。用优化后的培养基进行5 L(装液量2L，37℃)发酵罐上罐发酵，72h后得到的发酵液中Neu5Ac的最大产量为6.37g·L-1。
　　本研究开创了利用枯草芽孢杆菌对生产Neu5Ac所需外源基因neuBC基因进行整合表达，发酵生产Neu5Ac的研究，成功构建了Neu5Ac在枯草杆菌中的直接合成代谢途径。并通过对枯草杆菌工程菌进行培养基优化来提高Neu5Ac的产出量，为公认安全菌种GRAS（Generally Recognized as Safe）基因工程菌进行Neu5Ac的工业化生产提供了良好开端，同时可以为该方向的深入探索研究提供有效借鉴。