阿魏酸钠联合苦参素用药的抗渗出作用及机制研究

摘要

目的：
　　研究阿魏酸钠（sodium ferulate，SF）和苦参素（oxymatrine，OMT）的协同抗渗出作用及其作用机制。
　　方法：
　　1．采用冰醋酸诱导的小鼠腹膜炎模型，研究SF和OMT联合用药的体内抗渗出作用，并计算抑制率和ID50值。
　　2．采用显微镜分析法、ELISA法，研究SF和OMT联合用药对小鼠腹腔灌洗液中的白细胞数、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、C-反应蛋白（C-reactive protein， CRP）和γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)的影响。
　　3．小鼠大网膜HE染色，研究SF和OMT联合用药对大网膜血管内皮细胞形态和血管完整性的影响。
　　4．采用流式细胞仪检测SF和OMT联合用药对冰醋酸诱导的人脐静脉血管内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）体积的影响。
　　5．采用水通道蛋白1（aquaporins1，AQP1）抗原免疫组化染色，研究SF和OMT联合用药对小鼠大网膜血管内皮细胞及HUVEC细胞AQP1蛋白的表达的影响。
　　6．采用细胞划痕实验，研究SF和OMT联合用药对白细胞迁移的影响。
　　结果：
　　1．冰醋酸诱导的小鼠腹膜炎模型显示，SF或OMT单独给药组剂量大于62.5 mg/kg时，其腹腔渗出液的OD值比模型组降低，具有统计学意义，显示一定的抗渗出作用。SF单独给药组ID50值为372 mg/kg，最大抑制率为37.7％；OMT单独给药组ID50值为310.3 mg/kg，最大抑制率为41.9%。然而，SF和OMT联合用药剂量大于31.3 mg/kg（SF+OMT：9.7+21.6 mg/kg）时，即表现抗渗出作用，且呈剂量依赖性。SF和OMT联合用药组ID50值46.5+104.1 mg/kg，最大抑制率为59.7%，其作用明显优于SF和OMT的单方给药组。等效应线分析表明，联合用药对抑制腹腔液的渗出有协同作用。
　　2．显微镜细胞计数分析结果表明，与模型组相比，SF和OMT联合用药能够显著性降低腹腔灌洗液中白细胞数（P<0.05，P<0.01），抑制率高达72.6%。与模型组比较，OMT单独给药（43.1 mg/kg）能够显著降低腹腔灌洗液中白细胞数（P<0.05）；SF单独给药（19.4 mg/kg）对腹腔灌洗液中白细胞数未见显著性变化。腹腔灌洗液的ELISA分析结果表明，与模型组比较，SF和OMT联合用药能够显著性降低IL-6、CRP和IFN-γ水平（P<0.05，P<0.01），且低、中、高三个剂量呈剂量依赖关系。与模型组比较，OMT单独给药组（43.1 mg/kg）能够显著降低IL-6、CRP和IFN-γ水平（P<0.05）；而SF单独给药组（19.4 mg/kg）对IL-6、CRP和IFN-γ水平未见显著变化。
　　3．病理组织学分析发现，SF单独用药组（19.4 mg/kg）对小鼠大网膜血管内皮的损伤评分与模型组比较无统计学意义；OMT单独用药组（43.1 mg/kg）、SF和OMT联合用药组能够显著改善小鼠大网膜血管内皮细胞的损伤（P<0.05，P<0.01）。
　　4．流式细胞术分析结果表明，SF和OMT联合用药能够明显降低向前散射（Forward Scatter，FSC-A）（模型组：17.8±0.04，SF+OMT高、中、低剂量分别为：4.6±0.02、5.5±0.08和9.6±0.07；P<0.05，P<0.01）和侧向散射（Side Scatter，SSC-A）值（模型组：42.7±0.15，SF+OMT高、中、低剂量分别为：9.7±0.06、13.2±0.08和21.4±0.13；P<0.05，P<0.01）；OMT（200μmol/L）单组给药组亦能显著降低FSC-A和SSC-A值，而SF（100μmol/L）单独给药组的FSC-A和SSC-A值与模型组比较未见明显变化。
　　5．AQP1抗原免疫组化染色结果表明，AQP1蛋白在小鼠大网膜血管内皮细胞表面表达，呈棕黄色。与模型组比较，SF和OMT联合用药组能够显著增加AQP1在小鼠大网膜血管内皮细胞及HUVEC的表达（P<0.05，P<0.01）且呈剂量依赖关系，等同剂量的单独用药对小鼠大网膜血管内皮细胞的AQP1蛋白表达未见显著影响。与模型组比较，SF和OMT联合用药组在浓度达到50+100μmol/L时，显著增加HUVEC细胞AQP1蛋白表达（P<0.05，P<0.01）；SF和OMT单独给药组的药物浓度分别大于200μmol/L和400μmol/L时，HUVEC细胞上AQP1蛋白表达增加也具有统计学意义（P<0.05）。
　　6．RAW264.7细胞划痕实验显示，SF和OMT联合用药能够显著性的降低划痕区域的细胞数，抑制RAW264.7小鼠巨噬细胞的迁移，抑制率最大可达60.2%，明显高于单独用药（SF组抑制率：21.4%，OMT组抑制率：28.4%）。
　　结论：
　　阿魏酸钠和苦参素联合用药对冰醋酸诱导的小鼠腹膜炎有明显的协同抗渗出作用，其机制可能与降低炎症所致的毛细血管内皮细胞的损伤，降低白细胞的迁移有明显关系，血管内皮细胞上AQP1表达增加可能与药物对血管内皮细胞的保护有关，其机制有待于进一步研究。
　　研究创新点：
　　本研究揭示了SF和OMT联合用药的协同抗渗出作用，并解释了其作用机制与药物对血管内皮细胞的保护有关。

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符号说明

1 前言

1.1 炎症反应

1.2 急性炎性渗出

1.3 水通道蛋白

1.4 急性炎症的动物模型

1.5 本课题研究背景

2 SF和OMT联合用药的体内抗渗出作用研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学处理方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

3 SF和OMT联合用药对血管内皮细胞形态影响

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 统计学处理方法

3.4 实验结果

3.5讨论

4 SF和OMT联合用药对小鼠大网膜血管内皮细胞和HUVEC AQP1蛋白的表达的影响

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 统计学处理方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

5 SF和OMT联合用药对白细胞迁移能力的影响

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 统计学处理方法

5.4 实验结果

5.5 讨论

结论

参考文献

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