阿魏酸钠苦参素联合用药对脓毒血症的治疗作用及机制的研究

摘要

脓毒血症是由严重感染而引发的系统性炎症反应，容易导致多器官功能障碍综合征(MODS)，是临床上和重症监护室中病人死亡的常见原因之一。脓毒血症的主要发病机制在于失控的严重炎症反应扰乱了机体的正常循环和基础代谢状态，同时，研究也表明细菌内毒素也是诱发脓毒症的重要原因之一，脓毒血症一旦引发全身性炎症反应，能迅速造成器官损伤，有较高的自然死亡率。
　　本课题采用盲肠结扎穿孔的方法探索阿魏酸钠（sodium ferulate，SF）和苦参素（oxymatrine，OMT）联合用药对盲肠结扎穿孔所致的脓毒血症的保护作用，并探讨其作用机制。
　　取swiss小鼠，雌雄各半，体重18～22g，随机分为2组：每组10只，空白组（生理盐水）、模型组（生理盐水）。模型组采用盲肠结扎穿孔（CLP）造模，空白组模拟开腹手术。密切观察各组小鼠的死亡情况，记录小鼠的死亡时间，统计8h、16h、24h小鼠死亡率。采用CLP建造脓毒血症模型后，空白组没有小鼠死亡，模型组小鼠出现死亡现象。8h内模型组小鼠死亡率为0％，而16h内模型组小鼠死亡率为80%，24h时模型组小鼠全部死亡。
　　取swiss小鼠，雌雄各半，体重18～22g，随机分为4组：每组10只，空白组（8h空白组、16h空白组）、模型组（8h模型组、16h模型组）。实验前禁食不禁水12h。模型组小鼠均采用CLP造模，空白组小鼠模拟开腹手术。测定小鼠肺组织湿干比；用全自动分析仪测定血清中谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT）、谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminease，AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平代表肝损伤的程度。采用CLP手术后8h和16h小鼠肺组织湿干比重明显增加（8h和16h模型组分别为5.1±0.52和5.3±0.42，空白组分别为3.9±0.21和3.8±0.48），ALT、AST和LDH水平明显升高ALT：8h和16h模型组分别为96±7.81和99±9.20 U/L，空白组分别为43±4.65 U/L和43±3.52 U/L；AST：8h和16h模型组分别为66±5.47和78±6.64 U/L，空白组分别为97±17.29 U/L和96±13.28 U/L；LDH：8h和16h模型组分别为538±50.7和564±60.3 mmol/L，空白组为342±38.2 mmol/L和328±26.4 mmol/L，8h组和16h组比较，肺组织湿干比、ALT、AST和LDH水平未见明显统计学差异。
　　取swiss小鼠，雌雄各半，体重18～22g，随机分为9组：空白组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、7个复方组SF+OMT(1.6+3.4，3.1+6.9，6.2+13.8,12.3+27.7，24.8+55.2，49.6+110.4，99.2+220.8 mg/kg)，复方组按SF+OMT摩尔比1:2配比，每组5只。实验前禁食不禁水12h。模型组及药物组小鼠均采用CLP造模，空白组小鼠模拟开腹手术。药物组分别于造模后立即腹腔注射相应剂量药物，空白组和模型组给予等体积生理盐水。测定小鼠肺组织湿干比；用全自动分析仪测定血清中ALT、AST和LDH水平代表肝损伤的程度。实验结果显示，与模型组比较，其中SF+OMT剂量为6.2+13.8 mg/kg以上时，小鼠肺组织湿干比显著降低，血清ALT、AST和LDH水平明显降低（P<0.05），其中SF+OMT（12.3+27.7 mg/kg）保护效果达到高峰，继续增加剂量未见疗效明显增加，3.1+6.9 mg/kg及其以下剂量组未见明显的保护作用。
　　取swiss小鼠，雌雄各半，体重18～22g，随机分为7组，每组30只：空白组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、SF组(6.2 mg/kg)、OMT组(13.8 mg/kg)、三个复方组SF+OMT(3.1+6.9，6.2+13.8，12.3+27.7 mg/kg)，复方组按SF+OMT摩尔比1:2配比。实验前禁食不禁水12h。模型组及药物组小鼠均采用CLP造模，空白组小鼠模拟开腹手术。药物组分别于造模后立即腹腔给药相应剂量药物，空白组和模型组给予等体积的生理盐水。用全自动分析仪测定血清中ALT、AST和LDH水平代表肝损伤的程度；酶法测定肺组织和肝组织中丙二醛（Malondialdehyde，MDA)水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性代表肝组织氧化损伤的指标；酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清、肺组织和肝组织中C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)的水平代表肝组织炎症反应水平和药物的抗炎作用，并与SF（6.2 mg/kg）、OMT（13.8 mg/kg）单独用药的作用进行比较。与模型组比较，复方高、中剂量组小鼠肺湿干比明显降低（高、中剂量组分别为4.22±0.24和4.48±0.25模型组为4.88±0.35，P<0.05）；血清ALT、AST、LDH水平明显降低（ALT：高、中剂量组分别为67.51±6.84和82.44±6.03 U/L，模型组为96.88±5.68 U/L，P<0.05；AST：高、中剂量组分别为48.43±5.41和53.99±5.39 U/L，模型组为65.50±5.78 U/L，P<0.05；LDH:高、中剂量组分别为414.83±29.62和427.29±32.41 mmol/L，模型组为526.89±34.20 mmol/L，P<0.01）；肺组织和肝组织SOD活性明显增高（肺组织高、中剂量组分别为10.43±1.82和9.32±0.96 U/mg protein，模型组为7.93±1.68 U/ml，P<0.01；肝组织高、中剂量组分别为15.38±1.12和14.08±0.71 U/mg protein，模型组为13.68±1.33 U/mg protein，P<0.05）；肺组织和肝组织MDA水平明显降低（肺组织高、中剂量组分别为1.26±0.78和1.47±0.71 nmol/mg protein，模型组为17.4±0.85 nmol/mg protein，P<0.05；肝组织高、中剂量组分别为1.07±0.13和1.15±0.07 nmol/mg protein，模型组为1.33±0.09 nmol/mg protein，P<0.05），血清、肺组织和肝组织CRP水平明显降低（血清高、中剂量组分别为385.72±23.55和425.11±24.25 ng/ml，模型组为467.61±31.24 ng/ml，P<0.05；肺组织高、中剂量组分别为60.71±4.57和65.51±6.86 ng/mg protein，模型组为72.32±7.45 ng/mg protein，P<0.05；肝组织高、中剂量组分别为42.12±2.62和46.47±2.48 ng/mg protein，模型组为54.31±2.18 ng/mg protein，P<0.05），血清、肺组织和肝组织IL-6水平明显降低（血清高、中剂量组分别为109.39±20.59和154.45±25.84 pg/ml，模型组为273.97±17.57 pg/ml，P<0.01；肺组织高、中剂量组分别为11.35±1.41和11.87±1.57 pg/mg protein，模型组为15.11±1.16 pg/mg protein，P<0.01；肝组织高、中剂量组分别为12.43±0.86和14.70±0.92 pg/mg protein，模型组为18.60±1.14 pg/mg protein，P<0.01），血清、肺组织和肝组织IFN-γ水平明显降低（血清高、中剂量组分别为108.17±9.25和117.83±7.51 pg/ml模型组为129.09±12.58 pg/ml，P<0.05；肺组织高、中剂量组分别为16.50±1.58和18.30±1.15 pg/mg protein，模型组为21.02±2.97 pg/mg protein，P<0.05；肝组织高、中剂量组分别为18.28±1.75和20.79±0.99 pg/mg protein，模型组为26.26±1.03 pg/mg protein，P<0.01）。而SF、OMT单独用药组与模型组比较，各项指标均未见显著性变化。
　　体外抗氧化作用研究：采用LPS所致HepG2细胞损伤模型，评价SF和OMT联合用药（剂量分别是25+50，50+100，100+200，200+400，400+800μmol/L）在LPS损伤模型中的抗炎活性作用和保护效应。采用ELISA的方法测细胞上清液中IL-6的水平，流式细胞仪检测细胞上清液中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，计算两指标的IC50值，酶法检测细胞内MDA、SOD、CAT水平，并计算ED50值。体外观察SF和OMT联合用药对过氧化氢自由基（Hydrogen peroxide，H2O2）和超氧阴离子自由基（Superoxide anion，O2-.）的清除能力，并计算其IC50值。研究发现SF和OMT联合用药对HepG2细胞培育的上清液IL-6的抑制作用的抑制率最大可达69.78%，IC50值为186.77+314.28μmol/L，呈良好的剂量依赖关系。抑制率明显高于单独用药组（IC50值SF：346.68μmol/L，OMT：447.23μmol/L）。SF和OMT联合用药可以明显降低细胞上清液中ROS水平，抑制作用明显高于单方给药组（IC50值SF+OMT：56.24+112.49μmol/L，SF：355.58μmol/L，OMT：426.21μmol/L）。同时，等效应曲线分析说明，联合用药对降低细胞上清液中的ROS水平具有明显的协同作用。SF和OMT联合给药对MDA的抑制率最大可达43.06%，联合用药组对细胞内MDA水平（ED50值SF+OMT：20.94+41.89μmol/L）的ED50值明显小于单方用药组（ED50值SF：89.09μmol/L，OMT：72.38μmol/L）；SF和OMT联合用药明显提高细胞内SOD活性，其作用明显优于单独给予SF或OMT，联合用药组（ED50值SF+OMT：25.55+51.09μmol/L）的ED50值明显低于单方用药组（ED50值SF：480.86μmol/L，OMT：170.07μmol/L）；SF和OMT联合用药明显提高细胞内CAT活性，其作用明显优于单独给予SF或OMT，联合用药组ED50值为5.74+12.84 mmol/L，明显低于SF和OMT单独用药组的ED50值（SF：30.31mmol/L；OMT：21.33 mmol/L）显示联合用药作用明显优于单独给药。SF和OMT联合用药具有较强的清除H2O2和O2-.自由基的能力。联合用药组对O2-.自由基清除能力明显强于单独给药组，OMT单独用药组对O2-.自由基清除能力明显强于SF单独用药组。联合用药组IC50值为3.41+6.82 mmol/L，明显低于SF和OMT单独用药组的IC50值（SF：48.53mmol/L；OMT：14.91 mmol/L），协同作用分析显示，联合用药对O2-.自由基清除作用起协同作用；联合用药组对H2O2自由基清除能力明显强于单独给药组，OMT单独用药组对H2O2自由基清除能力明显强于SF单独用药组。联合用药组IC50值为4.84+8.42 mmol/L，明显低于SF和OMT单独用药组的IC50值（SF：27.88 mmol/L；OMT：16.55 mmol/L）。
　　阿魏酸钠和苦参素联合用药对CLP诱导的小鼠脓毒血症有明显的保护作用，机制可能与药物的抗炎和抗氧化损伤的作用有关。

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符号说明

1 前言

1.1 脓毒血症与炎症反应

1.2 脓毒血症与自由基损伤

1.3 本课题研究背景

2 盲肠结扎穿孔（CLP）小鼠脓毒血症模型的复制

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学处理

2.4 实验结果

2.5 讨论

3 阿魏酸钠和苦参素联合用药对小鼠盲肠结扎穿孔（CLP）导致的脓毒血症的保护作用预实验（药物剂量的选择）

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 统计学处理

3.4 实验结果

3.5 讨论

4 阿魏酸钠和苦参素联合用药对盲肠结扎穿孔（CLP）所致的小鼠脓毒血症的保护作用

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 统计学处理

4.4 实验结果

4.5 讨论

5 阿魏酸钠和苦参素联合用药抗炎作用机制的研究

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 统计学处理

5.4 实验结果

5.5 讨论

6 小结

参考文献

致谢

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