一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合、其制备方法和剂型及金莲花乙醇提取物的应用

摘要

本发明一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合、其制备方法和剂型及金莲花乙醇提取物的应用，属于医药技术领域。所述联合用药物组合，包括氟康唑原药和金莲花乙醇提取物，其中氟康唑原药和金莲花乙醇提取物的重量比为1:2.5。本发明的联合用药物组合具有以下优点：协同增效、优势互补；效果明显、安全，金莲花乙醇提取物能增加氟康唑的抗菌作用，减少氟康唑用量及其不良反应，并能降低白色念珠菌对氟康唑的耐药性，增加其抗菌活性；金莲花乙醇提取物可提高机体免疫功能，增强抗病能力，二者联合应用未发现毒副反应。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合、其制备方法和剂型及金莲花乙醇提取物的应用。

背景技术

念珠菌性阴道炎是女性常见的妇科疾病，大量研究表明,85％-90％感染是由白念珠菌引起。白念珠菌是人体的主要条件致病菌，免疫功能低下的人群易发病。目前，临床对念珠菌性阴道炎多应用唑类抗真菌药物，但随着对它们的大量应用，逐渐出现了对唑类药的耐药菌性，导致药物疗效的降低或无效。因此，寻找降低白念珠菌的抗药性药物及能增加唑类药物疗效的药物或方法非常必要。

金莲花(Trollius chinensis Bunge)是毛茛科植物，属药食两用品种，有着悠久的药用史。金莲花含丰富的黄酮类成分，具有抗细菌、抗病毒、抗氧化等多种药理作用。临床主要用于感冒、发烧、扁桃体炎、咽炎、尿路感染等的治疗，但有关金莲花抗真菌作用未见文献报道。

发明内容

念珠菌感染可引起皮肤、粘膜、指甲及深部组织念珠菌病，临床主要应用唑类抗真菌药，如氟康唑、咪康唑、酮康唑、伊曲康唑等。但随着唑类抗真菌药广泛长期应用，白念珠菌抗药性日趋严重，给念珠菌病的治疗带来严峻的挑战。联合用药可以减少药物用量，增强药效，降低药物不良反应，同时可避免耐药性的发生。

本发明的目的是提供一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合、其制备方法和剂型，该联合用药物组合为中西药联合用药，疗效明确，用量小，成本低廉，应用方便，解决背景技术中存在的上述问题。

本发明的另一个目的在于公开了上述联合用药物组合中金莲花乙醇提取物的作用。

本发明的技术方案是：

一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合，包括氟康唑原药，其中，所述联合用药物组合还包括金莲花乙醇提取物，其中氟康唑原药和金莲花乙醇提取物的重量比为1:2.5；

所述金莲花乙醇提取物是通过下述方法制备所得：

将金莲花干燥、粉碎后，按1g:20ml的比例加入70％乙醇，70℃水浴提取2次，每次2h，过滤，合并提取液，回收乙醇，将回收乙醇后的提取液70℃水浴干燥，即得金莲花乙醇提取物。

上述技术方案所述的一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合，其中，所述氟康唑原 料药的纯度＞99.8％。

一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合的制备方法，包括下述步骤：

(1)、首先备好纯度＞99.8％的氟康唑原药；

(2)、金莲花乙醇提取物制备：将金莲花干燥、粉碎后，按1g:20ml比例加入70％乙醇，70℃水浴提取2次，每次2h，过滤，合并提取液，回收乙醇，将回收乙醇后的提取液70℃水浴干燥，即得金莲花乙醇提取物；

(3)、将氟康唑原药与金莲花乙醇提取物按重量比为1:2.5混合均匀，得到抗白念珠菌作用的联合用药物组合。

一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合的剂型，其中，所述剂型为散剂、片剂或胶囊。本技术方案中，剂型为散剂时，临用前用蒸馏水配制成7％的溶液，用于局部给药，如皮肤、粘膜念珠菌感染；剂型为片剂或胶囊，可以口服用于深部组织念珠菌感染的治疗。

上述技术方案所述的剂型，其中，所述散剂、片剂或胶囊由上述技术方案所述的联合用药组合和药学上可接受的载体组成。

金莲花乙醇提取物在抗白念珠菌作用的联合用药物组合中增强氟康唑抗白念珠菌作用的应用。

将本发明的中西药联用的组方制剂应用于局部和全身白色念珠菌感染的实验动物，证明该组方能的金莲花乙醇提取物可增加免疫抑制小鼠的免疫功能和增强氟康唑抗白念珠菌的效应，能显著改善念珠菌感染小鼠的症状，降低其死亡率，未发现毒副反应。金莲花乙醇提取物与氟康唑联用对白色念珠菌不仅有协同相加作用，而且能明显降低白色念珠菌耐药性，从而增加氟康唑抗念珠菌作用。本发明具有制备工艺简单，疗效高、用量小、应用方便等特点。

本发明具有以下有益效果：

1、组方中成分来源广，经济易得；

2、复方制备工艺简单，不需要特殊仪器和设备，成本低；

3、应用方便,质量可控,本发明通过对西药氟康唑与金莲花乙醇提取物的组合,有利于发挥中药的多效性，即符合中药多部位、多靶点的整体调节机制，又体现了西药的专属性。具有协同增效，优势互补的作用；

4、效果明显、安全，金莲花乙醇提取物能增加氟康唑的抗菌作用，减少氟康唑用量及其不良反应，并能降低白色念珠菌对氟康唑的耐药性，增加其抗菌活性。

5、金莲花乙醇提取物可提高机体免疫功能，增强抗病能力，二者联合应用未发现毒副反应。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合作进一步的说明。

实施例1：一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合：

一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合，包括氟康唑原药，其中，所述联合用药物组合还包括金莲花乙醇提取物，其中氟康唑和金莲花乙醇提取物的重量比为1:2.5；

所述金莲花乙醇提取物是通过下述方法制备所得：

将金莲花干燥、粉碎后，按1g:20ml比例加入70％乙醇，70℃水浴提取2次，每次2h，过滤，合并提取液，回收乙醇，将回收乙醇后的提取液70℃水浴干燥，即得金莲花乙醇提取物。

以下通过具体试验例来说明本发明一种抗白念珠菌作用的联合用药物组合所具有的有益效果以及金莲花乙醇提取物在抗白念珠菌作用的药物组合物中增强氟康唑抗白念珠菌作用的应用。

试验例1：一种抗白念珠菌作用的中西药联合用药物组合局部用药实验：

该试验例是将金莲花乙醇提取物(EG)与氟康唑联合应用，观察局部应用对小鼠白色念珠菌性阴道炎的治疗作用。

1、材料：

1.1、实验动物：SPF级BALb/C，18-22g，雌性，无孕，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号:SCXK<京>2009-0004；小鼠饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK<京>2009-0008。动物在河北联合大学实验动物中心屏障环境实验室喂养和实验；

1.2、药物：金莲花乙醇提取物(extraction of globeflower,EG)制备：将金莲花干燥、粉碎后，按1g：20ml比例加入70％乙醇，70℃水浴提取2次，每次2h，过滤，合并提取液，回收乙醇，将回收乙醇后的提取液70℃水浴干燥，即得金莲花乙醇提取物(EG)。氟康唑原药(批号：131105，武汉东康源科技有限公司)；

1.3、主要试剂及用品：地塞米松磷酸钠注射液(济南利民制药有限责任公司，批号：11091114)；苯甲酸雌二醇注射液(天津必佳药业集团有限公司，批号：20120101)；PBS粉末(北京雅安达生物技术有限公司，批号：20120101)；沙氏培养基(SDA培养基)(北 京博星生物技术有限责任公司，批号：20110826.)；营养肉汤(北京博星生物技术有限责任公司，批号：20100730)；甲醛(北京雅安达生物技术有限公司，批号：20110910)。

1.4、实验菌株：白色念珠菌临床新分离菌株，由河北联合大学检验科提供，放4度冰箱保存。白色念珠菌的临床分离菌株经两次沙堡氏培养基活化(培养温度为37℃)，挑取新培养24小时的白色念珠菌菌落混悬于PBS液中，震荡使之充分混匀，应用血细胞计数板调节浓度至10⁷cfu·mL^-1(cfu:菌落形成单位)，现配现用。

2、方法：

2.1、联合用药物组合制备：

将氟康唑原药与金莲花乙醇提取物按重量比为1:2.5比例(即氟康唑1份，金莲花乙醇提取物2.5份)混合均匀，于乳钵中充分研磨后称7g，溶解于100mL蒸馏水中，安全柜下用0.45um微孔滤膜过滤除菌，备用。

2.2、小鼠白念珠菌阴道炎模型的构建：

菌悬液的准备：临床分离的白色念珠菌菌株经两次沙堡氏培养基活化(培养温度为37℃)，挑取培养24小时的菌落混悬于PBS液中，充分震荡混匀，应用血细胞计数板调节浓度至10⁷cfu·mL^-1(cfu:菌落形成单位)，现配现用。

小鼠白念珠菌阴道炎模型建立：70只小鼠，随机挑出10只为空白对照组,剩余60只皮下注射苯甲酸雌二醇注射液10mg/kg，隔日1次，共注射3次，使小鼠处于假发情状态；注射雌二醇4d开始，小鼠腹腔注射地塞米松15mg/kg，连续注射4天，造成小鼠免疫功能低下状态；于注射雌二醇6d(地塞米松3d)将密度为10⁷/mL个孢子的菌悬液用微量加样器吸取菌液20μL(即白色念珠菌孢子接种量为2×10⁵)，注入小鼠阴道内，接种后小鼠倒置2min以防止菌液外漏，24h后同样方法再感染1次。在接种白色念珠菌孢子后每天观察小鼠阴道红、肿及阴道分泌物等情况，并于接种3d用无菌PBS 100μL进行阴道灌洗，灌洗液涂片镜检，分泌物镜检可见假菌丝和成群孢子，即视为造模成功。

2.3、动物分组与给药：

小鼠共成摸43只，挑选状态良好的40只小鼠，按随机数字表法随机分5组，加正常对照共6组：①正常对照组，阴道中塞入浸有0.1mL灭菌蒸馏水的无菌棉球；②模型对照组，阴道中塞入浸有0.1mL灭菌蒸馏水的无菌棉球；③单纯氟康唑治疗组，阴道中塞入浸有氟康唑0.1mL(含2mg)的无菌棉球；④金莲花乙醇提取物(EG)组，阴道中塞入浸有EG 0.1mL(含5mg)的无菌棉球；⑤联合用药低剂量组，阴道中塞入浸有0.1mL氟康唑与EG混合液(含氟康唑1mg+EG 2.5mg)的无菌棉球。上述各组均于接种白色念珠菌孢子后3d开 始给药，每天1次，连续给药7天。

2.4观察指标： 

2.4.1、阴道分泌物念珠菌孢子转阴率及念珠菌载菌量(CFU)检测：

于给药第0、5、8天用100uLPBS灌洗阴道5-6次，灌洗液置于洁净无菌管中，取10μL即刻于清洁玻片上，镜下观察，未检出芽生孢子及菌丝者标记为“-”阴性，转阴小鼠数/该组小鼠总数为转阴率；另取10μL灌洗液用PBS 200μL倍比稀释后,用微量加样器取20μL接种于沙堡氏培养基平皿上，每个阴道洗液接种2个平皿，37℃培养48小时，计数每个平皿菌落数，求出同一标本2个平皿平均菌落数X，计算菌落形成单位(CFU)CFU/mL标本＝X×1/0.020×稀释度×1/标本体积。

2.4.2、阴道组织病理学检查：

于末次给药次日(给药第8天)阴道灌洗后，脱臼处死小鼠，立即取小鼠阴道及其周围组织作常规石蜡包埋，HE染色，镜下观察病理变化：即每张切片取上、下、左、右、中5个高倍视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及充血，水肿程度进行评分，无充血，水肿及炎细胞浸润0分，轻度评1分，中度评2分，重度评3分，每个鼠标本5个视野炎症评分平均值为该鼠的炎症严重程度，并求出各组小鼠总分值。

3、结果：

3.1、各组小鼠阴道灌洗液白色念珠菌直接镜检转阴率：

给药后第5、8天各组小鼠阴道灌洗液白色念珠菌孢子直接镜检结果见表1，氟康唑及EG单独应用对念珠菌均有一定的抑制作用，而二者联合应用，对念珠菌的抑制作用明显增加，其对孢子转阴率随着用药时间的增加而升高，达100％阴转；而不给药的模型组无转阴。

表1 给药第5、8天各组小鼠白色念珠菌孢子转阴数及转阴率(n＝10)

注：χ²＝27.565，P<0.005

3.2、各组小鼠阴道灌洗液白色念珠菌载菌量(CFU)：

表2结果显示，用药5、8天后，各组小鼠阴道灌洗液菌落计数，空白对照组未检出，模型组CFU值最高；与模型组比较，各给药组CFU值均明显降低(P<0.01)，氟康唑+EG 联合用药CFU值均明显低于各单独用药组(P<0.01)，治疗8天后效果更好。

表2 各组小鼠阴道灌洗液CFU(×10⁴CFU/mL)的影响(x±s,n＝10)

组别 给药剂量mg/只 第5天 第8天 对照组 - - - 模型组 - 11.57±0.57 10.88±0.63 氟康唑 2 9.58±0.54^b7.59±0.65^bEG 5 11.14±0.58 10.28±0.65^d氟康唑+EG 1+2.5 7.94±0.43^bdf4.63±0.52^bdf

^bP<0.01vs.模型组；^dP<0.01vs氟康唑组；^fP<0.01vs EG组；

3.3、阴道组织病理检查结果：

正常对照组小鼠阴道黏膜上皮光滑，无坏死脱落，黏膜下无充血、水肿、无炎细胞漫润；模型对照组小鼠阴道黏膜上皮坏死脱落，黏膜下充血水肿，大量炎细胞浸润，阴道内有大量炎性渗出物；各药物治疗组小鼠阴道组织病理改变有不同程度的减轻；联合用药组病理改变明显轻于单独用药组，多数小鼠阴道组织趋于正常，其病理评分值明显轻于模型组(P<0.01)，治疗效果与正常对照组相近。结果见表3。

表3 各组小鼠阴道组织病理评分结果

组别 0分(只) 1分(只) 2分(只) 3分(只) 平均分值(分) 对照组 10 0 0 0 0 模型组 0 0 2 8 2.800±0.422 氟康唑 0 2 5 3 2.100±0.737 EG 0 0 3 7 2.700±0.568 氟康唑+EG 4 2 3 1 1.100±0.735^bdf

^bP<0.01vs.模型组；^dP<0.01与氟康唑组；^fP<0.01与EG组

注：无充血，水肿及炎细胞浸润0分，轻度评1分，中度评2分，重度评3分，每个鼠标本5个视野炎症评分平均值为该鼠的炎症严重程度，并求出各组小鼠总分值。

试验例2：一种抗白念珠菌作用的中西药联合应用对小鼠念珠菌全身感染死亡率的影响：

联合用药物组合按照实施例1的方法制备。 

本试验例的联合用药组合剂型为胶囊，制备工艺如下:将氟康唑原药与金莲花乙醇提取物按重量比为1:2.5比例配伍(即氟康唑1份，金莲花乙醇提取物2.5份)混合均匀，加入糊精为赋形剂，制成胶囊剂，观察全身应用对小鼠白色念珠菌深部组织感染的治疗作用(死亡保护作用)。

1、所用动物及试剂同试验例1。

2、方法：

小鼠白念珠菌全身感染模型建立：50只小鼠，随机分为6组，每组10只。为空白对 照组和模型对照组每天灌胃生理盐水20ml/kg；单纯氟康唑治疗组每天灌胃氟康唑100mg/kg；金莲花乙醇提取物(EG)治疗组，每天灌胃EG 250mg/kg；联合用药治疗组，每天灌胃组合药175mg/kg。各组小鼠于给药同时腹腔注射地塞米松30mg/kg，连续注射4天，造成小鼠免疫功能低下状态。于末次注射地塞米松后将密度为10⁷/mL个孢子的菌悬液尾静脉注入小鼠体内，同时继续灌胃给药。在接种白色念珠菌孢子后每天观察小鼠一般状态、死亡等情况，共观察7d。

3、结果：表4结果可见，联合用药组小鼠死亡率及死亡时间明显低于模型组及单独用药组。

表4 各组小鼠死亡情况

试验例3：一种抗白念珠菌作用的中西药联合用药物组合体外抗白念珠菌的作用：

1、受试药物配制：

金莲花乙醇提取物(EG)溶液：取实施例1中的金莲花乙醇提取物于乳钵中充分研磨后称100mg，溶解于10mL营养肉汤中，得浓度10mg/mL的药液，安全柜下用0.45um微孔滤膜过滤，4℃冰箱保存备用。

同样方法制备氟康唑溶液(4mg/mL)。

氟康唑与EG组合液：取上述EG溶液与氟康唑溶液(4mg/mL)按1:1混合。

2、菌悬液的制备：

将平板上培养24h的活化白念珠菌，挑取菌落混悬于营养肉汤中，震荡使之充分混匀，应用血细胞计数板调节菌悬液浓度至100万个/mL。

3、MIC和MBC的测定：

每一药液挑选10支无菌中试管编号1-10，先无菌加入1.0mL肉汤至第1-9管内；药液采用二倍连续稀释法，加1.0mL供试药液至第1管，将第1管混合后取1.0mL至第2管，依次至第8管，再从第8管取1.0mL丢去；第9管加入供试药液1.0mL，不加菌作阴性对照，第10管只加菌液；第1-8管分别加入已准备好的1mL经稀释(含菌量约100万个/mL)的新鲜菌液，置37℃培养箱内培养24h后观察有无细菌生长，并记录。肉眼观察有无混浊，混浊为生长阳性，澄清为阴性。以肉眼观察，药物最低浓度管无菌生长者， 即为受试药的MIC。

将各药物试管摇匀后用加样器取10uL放到沙堡氏琼脂平皿上，用白金耳划线接种，培养48小时后观察有否菌落生长。沙堡氏琼脂平板上无菌生长，其含药浓度最低的1管，即为最低杀菌浓度(MBC)。

4、结果：表5显示，白色念珠菌对照管明显混浊，有大量念珠菌落生长；不加菌的阴性对照清亮透明，无菌生长。随着各管药浓度的降低，对白色念珠菌的抑杀作用也降低。氟康唑和EG单独应用对白念珠菌的MIC为0.25mg/mL和2.50mg/mL，MBC为0.50mg/mL和2.5mg/mL；而二者联合应用的MIC和MBC分别为0.016+0.040mg/mL和0.031+0.080mg/mL，氟康唑联合用药与单用药的效价比MIC和MBC均为1：15.625。

表5 EG对氟康唑抗白念珠菌MIC、MBC的影响

注MIC：-无混浊，+略混浊，2+较混浊，3+明显混浊

注MBC：-：无菌落；+：1-10个菌落；2+：21-30菌落；3+：多余31个菌落

以上体内实验应用小鼠白色念珠菌阴道炎模型，药物经阴道内给药途径，通过对小鼠阴道冲洗液念珠菌镜检孢子及菌丝转阴率和载菌量，以及阴道组织病理学检查等综合指标，分析了各药物治疗组对小鼠白色念珠菌阴道炎的治疗作用。结果表明，与模型组比较，各给药组真菌孢子转阴率增高、CFU值明显降低及阴道组织病理改变明显减轻，氟康唑+EG联合用药组均明显好于各单独用药组(P＜0.01)，以联合用药高剂量组效果最好，随着给药时间的延长和剂量的增加，作用也增加。

以上体外抗念珠菌实验结果显示：氟康唑和EG单独应用对白念珠菌的MIC为0.25mg/mL和2.5mg/mL，MBC为0.5mg/mL和2.5mg/mL；而二者联合应用的MIC和MBC分别为0.016+0.040mg/mL和0.031+0.080mg/mL，氟康唑联合用药与单用药的效价比MIC和MBC均为1：15.6，表明氟康唑与EG联合应用，达到同等效应时氟康唑用量降低了15.6倍；EG联合用药与单用药的效价比MIC为1：62.5倍，MBC为1：31.25，达到同等效应 时EG用量降低了31-62倍。表明二者联合应用对白念珠菌的抑杀作用均明显强于各自单独应用，二者具有协同和增强作用。

以上所述，本发明通过大量动物实验观察,取得了很好的效果。仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。