重组蜘蛛包裹丝蛋白AcSp1的表达纯化、成丝机理及性能研究

摘要

早在蜘蛛丝进入研究领域之前，人类已经开始利用蜘蛛丝了。在古希腊，人们利用天然蜘蛛丝缝合伤口;后来蛛丝用在军事上，可以用来做十字准线。现代随着对蜘蛛丝的关注和研究发现，蜘蛛丝在生物医学上有十分优良的应用前景，包括可以作为组织工程支架，药物运输载体和神经导管等。蜘蛛丝的诸多用途要归功于它的化学稳定性、生物相容性、丝质光滑且细的特点。不仅如此，它还具有很高的强度、弹性、柔韧性、延展性和抗断性以及轻盈、生物可降解等优点。蜘蛛丝所表现出来的优良性能是包括蚕丝在内的天然纤维和合成纤维所无法比拟的。
　　但是，目前为止对蛋白质丝应用得最多的是性能不如蛛丝的蚕丝，而对蛛丝的大规模生产和工业应用仍处于空白，主要有以下几个原因:(1)蜘蛛是肉食性动物，不易驯化，不能像蚕一样高密度饲养。此外，一个蚕茧产600至900米的纤维丝蛋白，而蜘蛛的囊状腺只能产生137米的丝，并且一个完整的蜘蛛网中的丝只有12米。(2)天然蜘蛛丝的组分，成丝机理和纺丝过程极其复杂。由于使用天然蛛丝回溶后纺丝这一过程会影响蛛丝的性能，因此无法纺出性能接近天然蛛丝的丝纤维，这对蜘蛛丝的应用来说是更是雪上加霜。(3)采用基因工程的方法在异源宿主中表达生产重组蛛丝蛋白是目前为止最有潜力的方法。但是这同样面临着困难，因为大部分蜘蛛丝蛋白的中央是高度重复的序列，其分子量可以达到300kDa以上，并且重复区富含甘氨酸和丙氨酸。在用异源宿主表达蜘蛛丝蛋白的时候不仅面临着密码子使用偏好性问题，这种序列特点同时带来了tRNA库需要共进化，同时这种高GC含量的DNA造成特殊二级结构，并导致基因重组。因此生产出来的蜘蛛丝蛋白达不到天然蜘蛛丝蛋白的大小，产量低，性能远不及天然蛛丝蛋白。
　　目前，国内外对蜘蛛丝的研究主要集中在以下几个方面:(1)天然蛛丝蛋白基因序列的获得和测定;(2)选择合适的宿主细胞表达分子量尽可能大且产量高的蛛丝蛋白，即人工生产蜘蛛丝方法的研究;(3)天然蛛丝成丝过程的研究(4)蜘蛛丝蛋白的内在结构与性能的关系，及成丝机理的研究;(5)改进蛛丝性能的研究。
　　圆网蜘蛛可以生产至少六种丝和一种粘性蛋白，这些丝可以用于织网，包裹猎物和结茧等。在众多种类的蜘蛛丝中，大壶腹腺(Major Ampullate，MA)丝形成拖丝，是所有蜘蛛丝中最强的丝也是研究得最多的。它的抗张强度可以和Kevlar媲美(4×109N/m2)，而它的弹性比Kevlar高7倍（拖丝35％，Kevlar5％）。蜘蛛的捕捉丝是粘丝，由鞭毛状腺和聚合腺生产，它很有弹性，而且可以伸长到原来的三倍而不断裂。蜘蛛包裹丝由葡萄状腺生产，因此也可以叫做葡萄状腺丝，用来包裹猎物，还可以用来建卵袋的内层结构。它在所有蛛丝中韧性最强，因为它综合了高强度和高弹性，在有外力强加到它时它可以吸收能量，不至于断裂。研究显示，来自Argiope trifasciata的包裹丝甚至比拖丝的韧性强50％。本论文中首次研究了异源表达Argiope trifasciata重组包裹丝蛋白，填补了除拖丝之外另一大类蛛丝蛋白的研究空白。
　　采用基因工程的方法生产蜘蛛丝的第一步就是获得编码蛛丝蛋白的DNA序列。在本论文中根据已知的来自Argiope trifasciata的包裹丝蛋白(AcSp1)重复单元DNA序列，优化了密码子使其适应于在大肠杆菌中表达，然后用化学合成的手段，获得包裹丝中央区单个重复单元的DNA片段。在该序列两端设计有合适的“无缝”限制性内切酶识别和切割位点，将这段序列连入合适的质粒载体，然后通过DNA酶切和连接的方法将单个重复单元首尾相连构建成含有两个重复单元的序列。用这样的方法继续拼接可以得到含有多个重复单元的DNA序列。同时将含有重复序列的蛛丝蛋白与融合蛋白(SUMO)融合表达可以提高蛋白可溶性和产量。采用这种方法在大肠杆菌中表达的蛛丝蛋白产量可以达到22-80mg/L。
　　在选择异源宿主细胞生产蛛丝蛋白方面，人们尝试过使用酵母、昆虫细胞、牛的乳腺上皮细胞、仓鼠幼崽的肾脏细胞、植物、动物和蚕。但是目前使用最多的还是在大肠杆菌中表达蛛丝蛋白。该表达系统可控性强，生产简单，成本低。但是由于原核和真核表达系统的差异性，使得原核表达的蛛丝蛋白大小远不及天然蛛丝蛋白。目前为止只有一个通过成功改造大肠杆菌基因组而表达出大小接近天然蛛丝大小的例子，但是该系统表达产量低，纯化效果不佳。因此，采用其他手段获得长度接近天然蛛丝大小的研究具有非常重要的意义。本论文中研究了分段表达蛛丝蛋白并成功改造了split-intein（断裂型蛋白质内含子），有希望将蛛丝蛋白片段在体外通过intein的自我剪接反应连接起来，从而获得大小接近天然蛛丝蛋白的重组蛛丝蛋白。
　　在成丝机理方面，目前有两种模型解释蛛丝形成:一种说法认为，蛛丝蛋白由于疏水作用先形成小球，这些小球聚集起来在拉力/剪切力的作用下形成含有β-折叠结构的丝纤维;另一种说法认为，丝蛋白分子先整齐排列形成小棒状结构的多聚体—液晶态结构，再在外力的作用下形成β-折叠结构。关于蛛丝蛋白在蜘蛛腺体内的生产和蜘蛛拉丝的研究结果仅限于对大壶腹腺蛋白，而对其他丝腺蛋白的研究仍处于空白。另外，研究发现在蜘蛛拖丝形成过程中伴随着化学环境的变化，其中包括钠离子和氯离子浓度的降低，钾离子、磷酸离子和氢离子浓度的升高。这些化学环境的变化及成丝模型是否适用于其他类型的蛛丝形成过程目前还是未知数。在本论文中采用了扫描电子显微镜、透射电子显微镜、原子力显微镜、圆二色光谱、拉曼光谱，核磁共振和纳米拉力测试仪等手段，研究了重组包裹丝蛋白体外成丝过程，包括其溶液中和成丝后的分子结构，分子聚集形态，发现了该蛋白自动成丝所需的最小重复单元数目，并测得了含有四个重复单元的包裹丝的强度平均为115MPa，比之前报道的可以自动成丝的拖丝蛋白略强，是天然包裹丝强度的1/6左右。溶液中和成丝过程中该重组包裹丝蛋白可以聚集成小球结构，小球结构在剪切力的作用下可以排列形成微丝结构，微丝再聚集并脱水形成成熟的丝结构，这验证和支持了小球理论。同时，在这一由液相到固相的转变过程中伴随着蛋白二级结构的转变，溶液中蛋白质的结构中富含α-螺旋而成熟的丝中富含β-折叠结构，与天然包裹丝的结构十分相似。
　　大部分蛛丝蛋白的二级结构组成上包含一个大的中央重复结构域，和N-端及C-端非重复结构域。C-端非重复结构域在蛋白质一级结构上相对于中央重复区结构域保守，所以人们推测它具有一定的功能。通过对重组拖丝蛋白的C-端非重复结构域的研究发现它可以帮助中央重复区形成排列具有一定方向性的丝。在对重组包裹丝AcSp1的研究后我们发现C-端非重复结构域不仅可以帮助蛛丝蛋白成丝，而且可以改善丝的力学性能，但是对所成的丝的表面结构没有明显影响。
　　本研究为帮助理解蛛丝蛋白形成过程、成丝机理及结构与功能的关系作出了一定贡献并提供了一个全新的系统。同时，实验中发现重组包裹丝蛋白形成的小球、膜及丝结构可能在生物医学及生物材料等方面有潜在的应用前景。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 蛛丝蛋白的种类

1．2 蜘蛛丝蛋白的生产

1．3 蛛丝蛋白的成丝

1．4 重组蜘蛛丝的研究进展及应用

参考文献

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验技术

参考文献

第三章 重组蜘蛛包裹丝的表达纯化及性能研究

3．1 研究背景

3．2 材料方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 结论

参考文献

第四章 包裹丝单个重复片断自组装的纳米结构研究

4．1 研究背景

4．2 材料方法

4．3 结果及讨论

参考文献

第五章 Argiope trifasciata包裹丝蛋白AcSp1中央重复单元的NMR结构研究

5．1 研究背景

5．2 材料方法

5．3 实验结果与讨论

参考文献

第六章 葡萄状腺丝蛋白C-端非重复区结构域的功能

6．1 研究背景

6．2 材料方法

6．3 实验结果与讨论

参考文献

第七章 筛选新型断裂intein用于拼接蛛丝蛋白

7．1 研究背景

7．2 材料方法

7．3 实验结果

7．4 讨论

参考文献

总结与展望

博士期间发表论文和参加科研情况说明

致谢

附录1：符号说明

附录2 Media and Buffer