二聚化蜘蛛拖丝蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

摘要

为了制备可用于蜘蛛拖丝蛋白体外检测的抗血清,本研究利用研究室前期工作中获得的、根据核心序列设计的二聚化蜘蛛拖丝蛋白基因构建原核表达质粒2S-pET-52b(+),并且通过原核表达的方式得到大量重组蜘蛛拖丝蛋白2S-His,对此重组蛋白进行His标签特异性的亲和纯化,并以纯化后蛋白作为抗原,在佐剂的辅助下对新西兰大白兔进行多点皮下注射免疫。研究所得结果:
　　 (1)原核表达载体构建:以2S-UHS-3.1为模板扩增得到含有蜘蛛拖丝蛋白二聚体基因的PCR产物片段;此PCR片段与线性载体pEasy-3.1相连,得到重组质粒2S-pEasy-3.1;利用引物引入酶切位点和pEasy-3.1载体本身酶切位点对重组质粒中2S两端进行特异性酶切,后将酶切所得2S片段与pET-52b(+)表达载体相连,最终得到可用于原核表达的重组质粒2S-pET-52b(+)。
　　 (2)重组蛋白的表达和纯化:将重组质粒2S-pET-52b-(+)转化入表达型感受态BL21-PLysS中,筛选得到表达状况最佳的菌株;对此菌株的表达条件进行摸索,最终得到重组蛋白2S-His原核表达的最佳IPTG诱导浓度,温度及时间条件。对重组蛋白进行His标签特异性的亲和纯化,得到可用于制备多克隆抗体的纯化后蛋白。
　　 (3)抗体制备:纯化后的2S-His蛋白经SDS-PAGE后切胶与佐剂混合乳化,用混合物对四只健康新西兰大白兔进行多点皮下免疫,经过三次免疫后两只兔子的抗血清经Elisa检测效价比较理想,其中,最高效价为1:25,600。
　　 上述研究结果,为利用2S-pET-52b-(+)重组质粒,采用原核表达的方式获得融合蛋白并纯化后用于抗体制备,最终将所得抗体用于蜘蛛拖丝蛋白的体外检测的方法奠定基础,还为加快建立在被毛中特异表达大量蜘蛛拖丝蛋白的新方法提供依据。