木质纤维素水解组分对细菌纤维素合成的影响

摘要

细菌纤维素（Bacterial Cellulose，简称BC）是一类由微生物生产的具有独特纳米三维网络结构的纤维素。它具有高比表面积，高纯度、高聚合度、高持水性、高结晶度、高抗张强度和良好的生物相容性等优异性能。作为一种新型的生物材料，BC在纺织、造纸、生物医学工程、功能材料和食品工业中具有广泛的应用前景，是目前国际生物材料研究的热点之一。制约BC大规模工业生产的主要因素是生产成本高、产率低。用价格低廉、来源广、可再生性的农林固体废弃物等木质纤维素原料制备BC，有望降低BC的生产成本。
　　木质纤维素通过预处理水解生成可发酵性糖，通常需要高温高压酸水解。然而在处理过程中产生了多种抑制微生物生长代谢的化合物，主要包括有机酸（甲酸、乙酸和乙酰丙酸）、呋喃衍生物（糠醛和5-羟甲基糠醛）、芳香族化合物等。这些物质的种类及含量与原料的种类、预处理条件等密切相关。在以水解物为发酵碳源时，这些化合物不仅抑制微生物的生长代谢，而且影响微生物对水解液中糖的转化利用。目前，对这些水解组分的研究主要集中在利用木质纤维素发酵生产乙醇的领域，譬如这些化合物对乙醇酵母的生长和乙醇发酵的影响上，而关于其对于木醋杆菌等细菌发酵生产BC的影响则未见任何报道。因此，本文针对BC的合成机制，研究木质纤维素水解液中主要的糖类、有机酸类、呋喃醛类和芳香族类化合物对木醋杆菌合成 BC的影响，包括菌体自身的生长代谢、培养基中生物转化物质的测定、培养基中 pH值的变化、碳源的消耗以及 BC的产量。通过对研究结果的分析，结合菌体的代谢途径，找出起主要抑制作用的化合物，探讨了这些物质对于BC合成的影响机理。并在研究的过程中建立了一种新型的快速检测细菌活性状态数量的荧光染色方法。
　　本文的主要研究内容和结果如下：
　　1.开发了一种可以快速检测培养液中细菌细胞活性状态的试剂盒，直观简便。试剂盒含有两种荧光染料，分别是花菁染料 SYBR GreenⅠ和碘化丙啶（PI）。两种染料的最佳染色浓度分别为4μM和10μg/mL，最佳染色时间为15 min。将染色的木醋杆菌的荧光强度与所检测的菌浓制成双对数曲线，其线性关系良好，且相关系数R2均大于0.98。根据概率统计中的t分布，当α=0.05，计算其置信区间，得出利用此曲线时所检测的菌体浓度范围需要控制在106至108 cells/mL之间。利用该方法测得木醋杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的相对活度％live bacteria(x)与Ratio G/R(y)呈线性关系，与Invitrogen公司市售试剂盒LIVE/DEAD? BaclightTM Bacterial Viability Kit L7012所检测的结果区别不大。对同一样品进行检测，荧光染色法比传统的涂平板法检测结果会高一个数量级，但是两者有很好的相关性，相关系数r2为0.9967。经尝试，该方法不能用于酵母染色。
　　2.以木质纤维素水解液中普遍存在的D-葡萄糖，D-木糖，D-甘露糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，D-阿拉伯糖和常用碳源D-果糖七种糖类作为碳源，在25 g/L和100 g/L两种浓度下研究比较了对木醋杆菌和红茶菌两种菌株生产BC的影响。结果发现D-果糖对两种菌种都是最合适的碳源。木醋杆菌能够利用D-木糖和D-半乳糖生产BC。红茶菌能大量消耗D-甘露糖，但是其BC的得率仅有0.1 g/g，消耗的D-甘露糖主要用于菌体自身的生长及其他代谢目的。这是首次发现红茶菌能够利用D-甘露糖，而 D-甘露糖在水解液中是很难被其他微生物利用的单糖之一。实验所得的BC的结晶度比较高，均高于73.2%。经过 SEM检测发现两类微生物生产的细菌纤维素的平均直径差异不大。
　　3.在培养基中分别添加木质纤维素水解液中常见的三种有机酸化合物（甲酸、乙酸和乙酰丙酸），研究其对木醋杆菌生长代谢和BC合成的影响。结果发现，甲酸对于菌体的抑制作用最强，且这三种有机酸对于木醋杆菌的抑制作用强度从大到小的排序为甲酸>乙酸>乙酰丙酸。木醋杆菌能够耐受培养基中25 mM的甲酸，当甲酸浓度高于100 mM时，菌体的生长受到明显抑制，且测不到BC的产量。乙酸对于菌体的抑制作用不明显,在加入乙酸的培养基中其 BC产量与空白培养基中的没有明显变化。当培养基中乙酸的初始浓度低于175 mM时，木醋杆菌能够代谢乙酸。木醋杆菌不能代谢利用乙酰丙酸，低浓度的乙酰丙酸能够促进木醋杆菌的生长并有利于BC的生产。在含有初始浓度为100 mM的乙酰丙酸的培养基中，所得的BC的产量为5 g/L，高于空白培养基中的产量3.5 g/L。甲酸对于木醋杆菌的强抑制作用机理可以用阴离子的富集理论来解释。
　　4.在培养基中分别添加木质纤维素水解液中常见的两种呋喃醛类化合物（糠醛和5-羟甲基糠醛），研究其对木醋杆菌生长代谢和BC合成的影响。结果发现，糠醛比5-羟甲基糠醛对于木醋杆菌的抑制作用更大。20 mM的糠醛可明显抑制木醋杆菌，而30 mM的5-羟甲基糠醛才会对木醋杆菌产生相同的抑制作用。木醋杆菌能够将低浓度糠醛转化为糠酸。当糠醛初始浓度为10 mM时，糠醛的转化效率最高，可达到88%。低浓度的5-羟甲基糠醛可提升BC的产量,木醋杆菌可将5-羟甲基糠醛转化为5-羟甲基-2-糠酸。当5-羟甲基糠醛的初始浓度为10 mM时，5-羟甲基糠酸的产量最高，可达76%。培养过程中，木醋杆菌对于呋喃醛物质进行的生物氧化还原反应可以看成是一种生物脱毒过程。
　　5.在培养基中分别添加木质纤维素水解液中常见的四种芳香族类化合物（松柏醛，阿魏酸，香草醛，4-羟基苯甲酸），研究其对于木醋杆菌的生长代谢和BC合成的影响。结果发现，松柏醛和香草醛对于木醋杆菌的抑制作用最强。当培养基中松柏醛的初始浓度为2.0 mM时，能够完全抑制培养基中菌体的生长代谢。当其浓度低于1.5 mM时，大部分松柏醛可被转化成阿魏酸和少量的松伯醇。实验发现与松柏醛有着相似分子结构的阿魏酸，在添加相同浓度（0~2 mM）下对于木醋杆菌的生长具有一定促进作用，但是未明显影响BC的产量。当香草醛的浓度达到2.5 mM或更高时，木醋杆菌的生长代谢和BC的合成均受到较强抑制。而当香草醛初始浓度低于2.5 mM时，其可被转化成香草醇和少量香草酸。木醋杆菌不能代谢4-羟基苯甲酸。该酚酸对木醋杆菌的增殖和葡萄糖的消耗速率均无明显影响,但是对于BC的合成具有一定的抑制。结果表明酚醛类物质比酚酸类物质具有更大的抑制作用。
　　通过以上几部分的研究发现，木醋杆菌和红茶菌能够利用木质纤维素水解液中大部分的可发酵糖作为碳源生产细菌纤维素，这些糖类物质进入菌体后参与的代谢网络的差异可能导致菌体对于不同单糖的利用效率不同。水解液中的芳香族化合物对于木醋杆菌的抑制作用明显大于有机酸和呋喃醛。木醋杆菌对于有机酸有较高的耐受性，对于低浓度的酚醛类和呋喃醛类化合物能够通过生物氧化还原反应对其进行脱毒转化，以降低其毒性。本研究结果为将来探索模拟真实水解液中的混合碳源和混合抑制物对菌体生产BC的影响做了铺垫，为今后以农林生物质为原料，规模化工业生产BC提供了重要的理论依据。

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第一章 绪论

1.1 细菌纤维素概况

1.2 细菌纤维素发酵原料的研究进展

1.3 纤维素废料制备细菌纤维素的生产技术

1.4 本课题的研究思路和主要内容

参考文献

第二章. 荧光染色法快速鉴别死活细菌

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

参考文献

第三章 糖类对细菌纤维素生产的影响

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

参考文献

第四章 有机酸和呋喃醛对细菌纤维素生产的影响

4.1 前言

4.2 实验材料和方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

参考文献

第五章 芳香族化合物对细菌纤维素生产的影响

5.1 前言

5.2 实验材料和方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

参考文献

第六章 结论与展望

6.1 结论与创新点

6.2 展望

攻读博士学位期间的研究成果

致谢