C位点突变在SR-BI介导的细胞胆固醇摄取及释放过程中作用的研究

摘要

目的： 观察研究SR-BI上C323位点突变后，对介导细胞选择性摄取胆固醇酯及游离胆固醇释放作用的影响，以进一步明确SR-BI上C323位点在SR-BI功能发挥中的作用。 方法： 1.免疫印记(Western Blot)检测细胞株SR-BI表达情况。 2.通过Caveolae Prep，从蛋白水平检测变异细胞株SR-BI的分布情况。 2.1用免疫荧光标记细胞株SR-BI，通过共聚焦显微镜观察变异细胞株SR-BI分布情况。 2.2通过生物素技术，标记变异细胞株细胞表面SR-BI，明确变异细胞株细胞表面SR-BI分布状况。 3.改进iodine monochloride method法，用125I标记HDL，改进Gwynne and Mahaffee文献中所述方法，用3H标记125I-HDL。 3.1使用同位素示踪技术，检测SR-BI介导细胞选择性摄取胆固醇酯情况，使用γ-计数器读取125I放射活性值，使用β-计数器读取3H的放射活性值。 3.2BCA法测定同位素样品中的细胞蛋白浓度。 4.参考Nancy Webb文献中所述方法，使用3H标记胆固醇，同位素示踪细胞内游离胆固醇释放情况，使用β-计数器读取3H的放射活性值。 5.酶切法切除SR-BI上糖基，应用免疫印记法检测酶切后SR-BI分子量的大小。 结果： 1.免疫印记结果：CHO-SR-BIC323G细胞株与阳性组细胞CHO-SR-BI一样，表达SR-BI，分子量为75KD；变异细胞株还表达分子量为100KD的SR-BI，其表达量少于分子量为75KD的SR-BI。 2.Caveolae Prep.结果：在细胞内，CHO-SR-BIC323G细胞株中的SR-BI与caveolin-1蛋白分布位置相同：均在代表细胞膜成分的PNS和代表Caveolae成分的CM里表达。 2.1免疫荧光标记后的细胞在共聚焦显微镜下显示：CHO-SR-BIC323G细胞株的SR-BI与CHO-SR-BI细胞株SR-BI分布位置相同，均与caveolin-1蛋白分布位置一样，位于细胞膜上的Caveolae内。 2.2生物素实验：CHO-SR-BIC323G细胞株与阳性对照CHO-SR-BI细胞株一样，在细胞表面有SR-BI的表达。 3.表示细胞中SR-BI与HDL结合量的125I放射活性值 3.1CHO-SR-BIC323G细胞株与CHO-SR-BI细胞株两两比较，CHO-SR-BI细胞株的125I放射活性值明显高于CHO-SR-BIC323G细胞株，有统计学意义；与CHO-vector细胞株两两比较，CHO-SR-BIC323G细胞株125I放射活性值稍高于CHO-vector细胞株，有统计学意义。 3.2表示SR-BI介导细胞选择性摄取胆固醇酯的3H放射活性值：CHO-SR-BIC323G细胞株与CHO-SR-BI细胞株两两比较，CHO-SR-BI细胞株明显高于CHO-SR-BIC323G细胞株，有统计学意义；与CHO-vector两两比较，CHO-SR-BIC323G与CHO-vector相同，无统计学意义。 4.SR-BI介导游离胆固醇释出的平均百分比：在各个时间点上，CHO-SR-BI细胞株明显高于CHO-SR-BIC323G细胞株，两两比较有统计学意义，CHO-SR-BIC323G细胞株与CHO-vector两两比较，二者相同，无统计学意义。 5.CHO-SR-BIC323G细胞株中SR-BI去糖基后，其分子量与阳性对照CHO-SR-BI细胞株SR-BI去糖基后分子量相同，为56KD。 结论： 1.C323位点是SR-BI上的关键位点，在SR-BI介导细胞选择性摄取胆固醇酯及游离胆固醇释放过程中，是不可缺少的。 2.C323位点的突变未改变SR-BI在细胞内外的分布位置。 3.SR-BI上C323位点突变后，其介导细胞选择性摄取胆固醇酯及游离胆固醇释放的能力显著下降。

目录

论文说明：符号说明

声明

前言

材料与方法

方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 清道夫受体(SR-BI)与动脉粥样硬化关系的研究

致谢