人肿瘤抑制因子Folliculin的原核表达、纯化及结构分析

摘要

Folliculin（FLCN）是由BHD基因编码的肿瘤抑制因子，BHD基因（亦称FLCN基因）突变或缺失会诱发一种常染色体显性遗传病——Birt-Hogg-Dubé（BHD）综合征，主要临床表现为毛囊错构瘤（头、脸、上部躯干等部位）、肺囊肿、自发性气胸及肾肿瘤等，其中肾肿瘤属于遗传因素引发肾癌的四大疾病（包括VHL综合征、遗传性乳头状肾癌、遗传性平滑肌瘤肾癌）之一。到目前为止，FLCN仍被认为是BHD综合征的主要诱发因子，但这种单基因遗传病的致病机理仍未知晓，至今仍缺乏针对性的治疗方案。因此，FLCN的结构和功能解析尤为关键。 FLCN是在人、大鼠、牛、果蝇和酵母等多物种高度保守的蛋白质。人FLCN基因位于常染色体17p11.2，编码579个氨基酸共64KD的蛋白。FLCN基因与BHD综合征相关的所有突变都发生在11个外显子上，主要为插入、缺失、无义和移码突变及引入一个过早的终止密码子，最终导致FLCN蛋白稳定性降低或失去功能。Nookala R.K.等（2012）利用X射线衍射技术解析了FLCN C端341-566氨基酸区段（FLCN-CT）三维结构，经结构比对发现其与DENN1B的DENN结构域相似，推测FLCN-CT具有鸟苷酸交换因子（GEF）的功能。另有发现FLCN有两个结合蛋白FNIP1和FNIP2，两者的保守性均很高，FNIP1与FLCN结合并磷酸化修饰FLCN，FLCN、FNIP1与AMPK结合，一起共同参与到mTOR信号通路中；FLCN通过C端与FNIP1和FNIP2结合，而BHD综合征中大部分FLCN的C端截断，也就是失去和结合蛋白的结合能力，那么说明它们之间形成复合体对于FLCN发挥功能是非常重要的。这些研究虽对FLCN-CT区域的结构和功能研究有所进展，但并未明确给出C端功能的实验数据及C端复合体的作用位点，而FLCN完整结构和功能更有待深入研究，这是解析FLCN突变或缺失导致BHD综合征致病机理的有效途径。 本课题旨在基于优化的原核表达系统获取高质量、高纯度的FLCN蛋白，并对其进行结构解析，同时结合生物信息学方法进行结构预测分析。首先利用密码子偏爱性原则优化FLCN基因以适合大肠杆菌表达系统，构建ppSUMO-FLCN（Full length，FL）、ppSUMO-N362（1-362a.a）重组质粒，转化至BL21宿主细胞诱导表达，高压破菌后利用镍亲和介质分离纯化(His) 6-SUMO-FLCN融合蛋白，随后利用ULP1酶切除(His) 6-SUMO Tag，再进行二次镍亲和层析和分子筛层析后获取纯度90%以上的FLCN目的蛋白（N362纯度为65%，有待进一步优化）。随后FLCN蛋白溶液经圆二色谱分析，获取远紫外检测结果（CDNN软件分析）显示：α-螺旋25.1%、β-折叠23.4%、β-转角19.3%和不规则卷曲32.2%。另外，还基于FLCN一级序列进行了结构分析，采用Thermo Scientific Vector NTI 11软件进行序列比对，利用MEGA6.0的Neighbor-joining（NJ）法进行系统进化树构建，证明FLCN在多物种中保守性很高，分析获取了高度保守区；基于predictprotein平台预测FLCN二级结构，α-螺旋预测比例和CD结果近似，FLCN的N端无序结构相对集中；运用ROSETTA软件进行FLCN三级结构预测，获取的C端区段预测的结果与已解析的结构非常类似，同时预测获取了一段90-214AA区段的三级结构，这为进一步的X射线晶体衍射实验解析FLCN完整结构的延续课题奠定了基础。同时为FLCN的功能分析提供了结构理论基础。

目录

第一个书签之前