中国特有小型猪内源性反转录病毒感染性克隆的构建与鉴定

摘要

异种移植，就是通过将动物器官、组织、细胞等移植到人体内，来解决机体组织器官功能障碍并达到治疗的目的。而人源供体器官的严重短缺，就需要通过异种移植作为替代途径解决。猪源器官的器官大小、生理学特点等都与人类相近，被认为是最合适的异种移植供体。异种移植中除了各种排斥反应、组织器官相容性等考虑外，最主要的担忧就是异种移植人兽共患病的跨种传播。研究发现猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus，PERV)体外能够感染包括人源细胞在内的多个细胞系，严重阻碍了猪→人异种移植的研究进程。
　　 我国有着异常丰富的猪种资源，其中各种小型猪是适合医学实验研究和人类异种移植的优良品种。目前我国的小型猪品系主要有：五指山猪、贵州小型猪、广西巴马小型猪、版纳小型猪等。在解剖学特征、生理学特性、营养代谢等方面与人类极为相似，非常适合用于人的异种器官移植，将来很有可能发展成为异种移植的优良供体。本研究室在对我国主要小型猪PERV存在及表达情况的研究中发现，所有不同种系中均存在PERV，但病毒拷贝数不同，其中五指山猪基因组中PERV的拷贝数较低，因而更适合于异种移植。
　　 PERV以前病毒DNA形式整合到猪细胞基因组中，并随染色体的复制而复制，因此无法从正常的细胞或组织中彻底消除。虽然大部分的研究结果均表明PERV并不引起任何感染性疾病，而且PERV感染人源细胞后也没有发生细胞病变，但这种隐性感染是否会如同其它反转录病毒一样通过潜在的与宿主细胞相互作用引发肿瘤或者癌变?一旦猪源器官或细胞移植到高度免疫抑制的患者体内时，PERV的跨种感染及表达情况又是如何?其潜在的病理效应仍然是个不可轻视的问题。深入研究PERV分子生物学特性，能够了解病毒的生命调控过程，阐明病毒感染、组装、整合机制，为研究PERV与宿主细胞间的相互作用、探索PERV感染人源细胞后可能产生的效应奠定分子基础。
　　 然而，由于RNA病毒体外操作困难，对反转录病毒的复制、组装和侵入分子机制，病毒生活周期以及病毒与宿主细胞相互作用等的研究进展一直停滞不前，直到二十世纪七十年代末，随着反向遗传学技术的推广以及感染性克隆技术的广泛应用，RNA病毒的研究瓶颈得到突破并取得了诸多重大成就，该技术实现了在DNA分子水平上对RNA病毒的体外操作，是用于研究病毒组成结构以及生物学功能很好的方法，也称之为病毒拯救。在国外，目前已构建成功PERV-A、PERV-B等多株不同猪种感染性克隆，并对其复制机制以及分子生物学功能进行系统研究，而我国至今尚未见PERV感染性克隆构建的相关报道。
　　 本研究以五指山来源小型猪为研究对象，构建五指山猪来源PERV感染性克隆，为下一步研究五指山猪PERV分子生物学特性奠定基础。首先根据GenBank上PERV序列(No.EF133960)设计两对引物分别用于扩增PERV5'half和3'half两个片段，并根据pBluescriptⅡ SK+载体特点，在5’half的5’端添加SalⅠ酶切位点。3’half的3’端添加XbaⅠ酶切位点，两片段重叠处均有PERV中唯一的NheⅠ酶切位点，首先通过PCR扩增得到五指山猪PERV前病毒全基因，根据基因克隆和重组等技术获得pBluescript SK+-WZS-PERV全基因克隆，并经菌落PCR和酶切鉴定正确。根据此方法共构建9个PERV前病毒全基因克隆用于感染性克隆的筛选。将9个全基因克隆分别转染HEK293细胞后，经PCR、RT-PCR鉴定分析，结果发现仅有1个全基因克隆转染后细胞中有PERV三种结构基因的存在与表达，将该克隆命名为WZS-PERV(2)。收集转染后的细胞培养上清，感染新的HEK293细胞，通过PCR鉴定PERV已经整合入HEK293细胞基因组中。将病毒盲传6代，采用基于SYBR GreenⅠ的实时荧光定量RT-PCR方法对PERVmRNA表达情况进行初步分析，结果均为阳性，此外，相对定量分析结构显示各代次间PERV mRNA表达情况存在差异。采用SDS-PAGE电泳及Western Blot检测分析PERV-Gag蛋白的表达情况，在WZS-PERV(2)转染以及病毒感染后的HEK293蛋白样品中均出现60kDa、40kDa、27kDa的预期条带，说明细胞中存在PERV-Gag蛋白的特异性表达。同时运用间接免疫荧光法分析PERV在HEK293细胞中的表达情况，激光扫描共聚焦显微镜观察到PERV感染后HEK293细胞胞浆中显示绿色荧光，进一步证实细胞中表达了PERV-Gag蛋白。通过透射电子显微镜观察到较典型的PERV病毒粒子。对感染性克隆进行序列测定后发现，序列中gag、pol、env三个编码基因均具有完整的ORF，以及两端的LTR，基因组全长为8939bp，将序列与GenBank中其他PERV序列进行比对分析，同时进行文献调研，结果发现，在该序列的LTR中含有典型的21bp(417bp～437bp)-24bp(438bp～461bp)-37bp(464bp～500bp)区域，即与文献中报道的PERVA/C重组毒株的LTR区域具有相同的特点，但存在数个碱基的突变，该结果初步说明：在本研究中获得的五指山猪来源的PERV感染性克隆具有PERV-C亚型的LTR及PERV-A亚型的受体结合区(RBD)序列，因此也属于PERVA/C重组毒株，而且该克隆能够在体外感染人胚肾细胞HEK293，即具有嗜人性特点。此外，通过生物信息学方法分析还发现，在LTR序列中的21bp-24bp-37bp区域，存在NF-Y等多个转录因子结合位点，因此该区域应为影响嗜人性PERV感染性的区域。
　　 结合前期对五指山猪的研究工作还发现，五指山猪近交系繁育多代后，PERV的序列中发生了较多的G→A突变，结合目前天然免疫抗病毒分子猪APOBEC3F(pA3F)效应机制分析，我们推测，可能是APOBEC家族成员pA3F的作用使PERV发生了较多G→A突变，但具体的作用机制以及发生突变的原因还有待进一步验证，因此本研究也为PERV变异特征及其机制研究提供线索。
　　 本研究在成功构建我国五指山猪来源的PERV前病毒全基因克隆后，首次构建并筛选获得PERV感染性分子克隆，这对于阐明嗜人性PERV的生物学特性，探索PERV感染人源细胞后可能产生的潜在的生理病理效应，以及分析和评价其在猪-人异种移植中的病原安全性都具有重要意义。在感染性克隆的基础上，还可以对PERV各编码基因进行改造，通过缺失、突变、嵌合以及修饰等方式，更好的对关键编码蛋白区域进行功能分析，帮助了解PERV生命调控过程和潜在致病分子机制，进行抗病毒研究。此外，PERV感染性克隆还可用于反转录病毒载体、新型核酸疫苗等研究，为最终实现猪→人异种移植奠定分子基础。