新生隐球菌与小胶质细胞相互作用中差异表达蛋白质的研究

摘要

新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)主要侵犯中枢神经系统(CentralNervousSystem，CNS)，隐球菌性脑膜炎或脑膜脑炎是最常见的临床形式。目前新生隐球菌和中枢神经系统的之间的关系还不是十分清楚。小胶质细胞是中枢神经系统的抗原递呈细胞和巨噬细胞，对新生隐球菌具有吞噬、杀菌、抗原提呈等作用；而新生隐球菌自身的的毒性因子，可以起到帮助其逃避吞噬等作用，从而在小胶质细胞内寄生繁殖再感染;二者之间相互作用的过程中，一些相关蛋白的表达会发生变化，直接研究这些蛋白的变化有助于直观了解新生隐球菌在中枢神经系统的发病机理。蛋白质组学研究己成为当前生物医学研究的重点，其技术的发展已经使直接大规模研究蛋白质组成为可能。该课题应用蛋白质组学的核心技术(二维电泳和质谱分析)研究了新生隐球菌和小胶质细胞作用前后的蛋白质组变化，为新生隐球菌性脑膜炎的致病机理研究打下基础。 该课题共分三部分：第一、二部分研究新生隐球菌和小胶质细胞作用前后表达有差异的蛋白质，第三部分研究无荚膜新生隐球菌对小胶质细胞凋亡的影响。 目的 第一部分研究鼠小胶质细胞N9和新生隐球菌标准株32609作用前后小胶质细胞有差异表达的蛋白质。 第二部分研究新生隐球菌标准株32609被鼠小胶质细胞N9吞噬前后新生隐球菌有差异表达的蛋白质。 第三部分分析无荚膜新生隐球菌CAP64对小胶质细胞N9的凋亡影响。 方法 第一部分将对数生长期的N9细胞与新生隐球菌32609按细胞：菌=1：10共孵育72小时，然后收集和提取N9细胞蛋白质做为实验组，未作用的N9细胞蛋白质做对照组；实验组和对照组分别做二维双向电泳，找出差异蛋白点做质谱分析，经蛋白质数据库鉴定蛋白质，蛋白质功能文献分析。 第二邵分将对数生长期的小胶质细胞与新生隐球菌32609共孵育，提取收集被N9吞噬的新生隐球菌的蛋白质作为实验组，提取单独培养新生隐球菌的蛋白质作为对照组，两组做二维双向电泳，差异的蛋白质点做质谱分析，经蛋白质数据库鉴定蛋白质，蛋白质功能文献分析。 第三部分将对数生长期的N9细胞分别与无荚膜新生隐球菌CAP64、灭活的无荚膜新生隐球菌CAP64共孵育，设定为实验组和灭活组；未孵育的小胶质N9细胞为对照组，用流式细胞仪检测5个不同时段(2h、4h、8h、16h、24h)N9细胞的凋亡指数。 结果 第一部分得到了N9细胞的对照组和实验组的二维电泳图，经二维图像分析软件分析，对照组和实验组分别检测出701个蛋白点和980个蛋白点，N9细胞经过与新生隐球菌孵育后的蛋白质组表达有增加趋势。鉴定出了下列10个蛋白质：Aldosereductase(AR)，Anillin，Pericentrin2,NucleosidediphosphatekinaseA(NDPKA)，Rho/Racguaninenucleotideexchangefactor2,RhoGDP-dissociationinhibitor2，GMP-PDEbeta，Selenium-bindingprotein2，Ferritinlightchain1，Activinbeta-Achain。 第二部分建立起新生隐球菌被小胶质细胞N9吞噬模型，观察到新生隐球菌32609被N9细胞吞噬。对照组和实验组分别检测出647个蛋白点和561个蛋白点，新生隐球菌被吞噬后蛋白质组表达有所减少。该文选取了其中10个差异蛋白点，鉴定出了下列5个蛋白质：Flavohemoprotein，Mitochondrialinnermembraneproteasesubunit1，DNA-damageinducibleproteinDIN7，Sisterchromatidcohesionprotein，Histonetranscriptionregulator1。 第三部分小胶质细胞N9与无荚膜新生隐球菌CAP64孵育后，5个不同时段(2h、4h、8h、16h、24h)N9细胞的平均凋亡指数分别为9.33％、12.93％、15.37％、16.30％、20.5％分别与空白组平均凋亡指数(1.33％，3.03％，3.23％，5.03％，6.87％)，灭活组平均凋亡指数(0.8％，1.7％，3.5％，3.7％，5.40％)有显著差异(P＜0.05)。 结论 第一部分这10个鉴定出的蛋白质涉及小胶质细胞N9的糖代谢、细胞骨架、信号传导，金属和微量元素四个方面。醛糖还原酶(AldosereductaseAR)涉及糖代谢多元醇的通路，AR表达上调，会导致山梨醇在细胞内堆积，进而会产生渗透性损伤，第一次揭示临床上新生隐球菌性脑膜炎表现的高颅压与细胞内水肿有关。Anillin，Pericentrin2，NDPKA和细胞骨架有关：Anillin是一种肌动蛋白结合蛋白，其调节着肌动蛋白丝的运动。Pericentrin2则和细胞有丝分裂和减数分裂时微管开始排列有关。NDPKA则为细胞骨架的活动提供能量。Rho/Racguaninenucleotideexchangefactor2，RhoGDP-dissociationinhibitor2，GMP-PDEbeta三个蛋白和细胞信号传导有关：新生隐球菌的配体(第一信使)特异地与细胞表面的G蛋白偶联受体结合，刺激细胞产生胞内调节信息分子cGMP(第二信使)，并将信息传递到细胞特异的反应系统，产生病理性应答反应。证实新生隐球菌对小胶质细胞信号可通过细胞G蛋白偶联受体通道传导。Selenium-bindingprotein2是硒结合蛋白，介导形成硒蛋白，起到保护细胞不被氧化的作用。Ferritinlightchain1功能和铁蛋白有关。Activinbeta-Achain具体功能不清楚，可能和神经细胞存活有关。 第二部分首次发现新生隐球菌有Flavohemoprotein，该蛋白可将一氧化氮(NO)转化为硝酸盐，从而保护其不受小胶质细胞产生的一氧化氮(NO)的杀伤，该蛋白可能是一个新的毒性因子；Mitochondrialinnermembraneproteasesubunit1该酶可以催化去除信号肽，表达上调提示进入线粒体的蛋白增多，提示新生隐球菌被吞噬后可能所需的能量合成增加；DNA-damageinducibleproteinDIN7和DNA修复有关，提示新生隐球菌被吞噬后其DNA可能受到损伤，需要该蛋白修复，是一种自我修复机制的表现。Sisterchromatidcohesionprotein和Histonetranscriptionregulator1两个蛋白具体功能尚不明确。 第三部分有活力的CAP64才能引起小胶质细胞的凋亡，证实荚膜不是唯一诱导细胞凋亡的因素，新生隐球菌其它的毒性因子在诱导小胶质细胞凋亡过程中发挥了作用。

目录

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英文详细摘要

前言

第一部分：小胶质细胞与新生隐球菌作用前后小胶质细胞差异蛋白质的研究

引言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分：新生隐球菌被小胶质细胞吞噬前后差异蛋白质研究

引言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

无荚膜新生隐球菌CAP64对小胶质细胞凋亡的影响

引言

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

参考文献

小结和展望

综述 蛋白质组学技术进展及在真菌研究中的应用

致谢

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