结核分枝杆菌毒力基因mce1a侵袭性机制研究及微生物16S rDNAs快速分类鉴定

摘要

近年，结核分枝杆菌(Mtb)感染所致结核病(TB)的发病率和死亡率一直高居不下。在全球，Mtb感染者几占总人口的三分之一，每年TB新发和死亡患者分别在900万和200万人左右。本研究立足于Mtb侵袭相关基因mce1a，首先，探讨了该基因在Mtb潜伏生存与活性增殖状态下的表达特性，并对其全长和截短序列分别进行了克隆、原核表达及纯化。其次，设计、转录合成了两条mce1a特异性小干扰RNAs(siRNAs)，并通过HEK293-T细胞，对siRNAs的抑制活性与抑制效率进行了鉴定。在上述工作基础上，进一步通过小鼠巨噬细胞RAW264.7和人结肠癌上皮细胞CT26.CL25，进行了T-Mce1A蛋白的细胞刺激实验、mce1a特异性siRNA的体外干扰实验以及重组E.coli(表达完整Mce1A蛋白)的体外侵袭实验，着重探讨了Mce1A蛋白介导细菌侵袭的作用机制。此外，本研究还通过对多种微生物16SrDNAs的序列比对与进化树分析，分别设计、合成了细菌通用及特异性引物，建立了实时荧光定量PCR(FQ-PCR)快速分类与检测方法。 一、毒力基因mce1a在Mtb潜伏生存与活性增殖状态下的表达特性Mtb属专性需氧细胞内寄生菌，感染后能在宿主体内以休眠状态长期潜伏生存，并在一定条件下复苏、大量增殖从而引发疾病。鉴于Mtb在低于25℃时停止生长，故低温条件下长时间存活的Mtb菌株可以作为一种非增殖状态的体外模型。本研究选取两种标准株(强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra)及八种临床分离株(非耐药四株，耐利福平或异烟肼各两株)，分别以4℃保存3m与37℃培养2w～5w为其潜伏生存和活性增殖状态。通过溶菌酶、蛋白酶K及1％SDS裂解Mtb，提取、纯化总RNA，并以不含RNase的DNase消化去除DNA。设计、合成mce1a特异性引物，以看家基因16SrRNA为平行参照，通过RT-PCR分别检测上述样品mce1a的表达。结果显示，处于非增殖期的十种Mtb菌株，mce1a基因均未见表达；而处于活性增殖期的上述菌株，mce1a基因均有稳定表达，且在不同菌株的表达水平相似。上述结果初步提示，mce1a基因的表达可能与Mtb侵袭力或潜伏生存能力有关。 二、Mce1A蛋白介导细菌侵袭的作用机制首先，进行了全长与截短mce1a基因的克隆及原核表达。设计Exo-primer、In-primer及In-primer2共三对引物，通过巢式PCR，分别扩增Mtb(H37Rv)全长与截短的mce1a基因——mce1a和T-mce1a，并将其克隆至6×His原核表达载体pROEX-HTb和热诱导表达载体pBV220，分别通过IPTG或42℃加热诱导目的基因的表达，并进行Ni-NTA柱纯化或分子筛纯化。对菌体样品和纯化样品分别进行SDS-PAGE分析，并对pROEX-mce1a菌体样品及纯化产物，以抗6×HisMAb进行Westernblot鉴定。结果显示，(i)对pROEX-mce1a和pBV-Tmce1a转化菌，分别在约45KDa和27KDa处有目的蛋白条带，与预期分子量基本一致；完整的Mce1A蛋白(含N端信号肽)以非可溶性表达，且可能稳固表达于细菌细胞壁或细胞膜；截短的T-Mce1A蛋白(为活性部分，不含N端信号肽)则主要以包涵体形式表达，部分(约1/3)以可溶性表达，侧面反映了N端疏水性信号序列对Mce1A定位的影响。(ii)经Ni-NTA柱纯化或包涵体变性、复性及分子筛纯化，均可获得相应分子量的目的蛋白，但Mce1A因其膜表达特性导致表达量及纯化得率均较低，T-Mce1A则因表达量高(菌体总蛋白的20％)而有较高得率与纯度。 其次，进行了特异性siRNAs的设计、转录合成，以及在HEK293-T细胞内靶向mce1a的干扰实验。为便于检测，将全长mce1a克隆至增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein，EGFP)基因的上游，构建表达Mce1A-EGFP融合蛋白的真核质粒pEGFPN1-mce1a。以在线软件“siRNATargetFinder”及“BLAST”设计、筛选靶向mce1a的siRNAs模板，通过T7体外转录试剂盒，合成si312(特异性)、si410(特异性)、siEGFP(阳性对照)和siIRR(阴性对照)等siRNAs。应用脂质体，将pEGFPN1-mce1a质粒或分别与2.0μl各siRNAs(约1.5nmol/μl)共转染HEK293-T细胞，通过荧光显微镜、半定量RT-PCR及Westernblot，对特异性siRNAs的抑制活性进行初步鉴定。进一步，将各siRNAs分多个剂量梯度共转染，并通过荧光显微镜、流式细胞术、FQ-PCR及Westernblot，对siRNAs的抑制活性与抑制效率进行了检测。结果显示，(i)通过T7RNA聚合酶体外转录的方法，在24h内能大量获得长度为21bp的特定siRNAs；通过脂质体共转染，可实现siRNAs向靶细胞内的高效递呈；并且，HEK293-T能高效表达mce1a基因，可作为相关研究的理想细胞株。(ii)在转录水平，si410和si312对mce1amRNA的抑制效率达90％和88％，均接近siEGFP(92％)；在翻译水平，si410和si312对Mce1A蛋白的抑制效率达51％和49％，略低于siEGFP(70％)。(iii)Westernblot显示，在约85kDa处呈现两条紧密条带，推测Mce1A-EGFP在HEK293-T细胞内表达时，部分融合蛋白可能会发生糖基化修饰。(iv)上述结果还提示，靶向相同基因的不同siRNAs，其达到相同抑制效率的起效时间有所不同，推测可能与不同siRNAs参与形成的RISC复合物切割靶mRNA效率不同有关。 再次，在上述研究基础上，探讨了Mce1A蛋白介导细菌侵袭的作用机制。一方面，在已获得纯化T-Mce1A蛋白以及高效、特异抑制活性siRNAs的基础上，分别以正向(不同浓度T-Mce1A刺激)和反向(si410干扰Mce1A表达水平)分析的方法，探讨了T-Mce1A对巨噬细胞TLR-2受体及相关信号分子水平的影响。另一方面，以能表达完整Mce1A的重组E.coli对RAW264.7和CT26.CL25细胞进行了体外侵袭实验。结果显示，(i)T-Mce1A刺激可直接导致RAW264.7细胞TLR-2表达上调，并进一步引起下游的炎症性信号分子IRAK-1和TRAF-6表达增高；其中，IRAK-1的表达水平改变尤为显著。鉴于TLR-2、IRAK-1及TRAF-6的活化可导致核转录因子NF-κB的激活，而NF-κB在细胞炎症反应中起中心调控作用，因此，Mce1A蛋白对TLR-2乃至IRAK-1和TRAF-6的激活作用，可能是Mtb引发宿主细胞炎症应答反应的重要因素之一。(ii)重组菌获得了侵袭及细胞内生存能力，能在RAW264.7细胞内生存至少48h；并且，受染细胞出现系列病理性变化。尤其在RAW264.7细胞，重组菌可引起细胞及细胞核明显变大、细胞膜显著突起，甚至导致多个细胞的融合，这些形态学变化提示了细胞骨架的改变。这进一步提示，表达Mce1A的重组E.coli具有一定侵袭性作用，可在一定程度上逃避巨噬细胞的免疫清除；并且，Mce1A蛋白介导的侵袭性作用可能与靶细胞发生骨架重排有关。 总之，综合分析本研究的上述结果，可初步推断，Mce1A蛋白可能通过激活TLR-2受体及其下游IRAK-1等炎症性信号分子，从而参与调节宿主炎症应答反应，最终介导了Mtb的侵袭过程，并促使入侵的Mtb在逃避宿主免疫清除后直接引发疾病或进入潜伏状态。结合近年关于李斯特菌、沙门菌、志贺菌、耶尔森菌及鸟分枝杆菌复合物(MAC)侵袭性机制的文献报道，可进一步提出：(i)Mtb可能具有与MAC相同或相似的侵袭机制——“拉链-触发”双重机制；(ii)Mce1A参与的宿主炎症应答调节作用，有可能是“拉链-触发”等相关骨架重排的重要始动因素之一。 三、微生物16SrDNAsFQ-PCR快速分类与鉴定对58株细菌、衣原体和支原体的16SrDNAs或真菌的18～28SrDNA进行多序列比对与进化树分析，选择高度同源区域设计通用引物，选择不同菌株的特异性序列设计特异引物。提纯绿脓杆菌、金黄及柠檬色葡萄球菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮及溶血性葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌、结核杆菌、解脲脲原体、白色念珠菌及克柔氏念珠菌等数十种标准和(或)临床菌株总DNA。分别以通用和特异引物对上述所有细菌16SrDNA靶片断进行PCR扩增，并构建重组pMD18-T作为FQ-PCR检测的标准质粒。以TaKaRaSYBR(R)PremixExTaqTM试剂建立20μl反应体系，对梯度稀释的各总DNA样品进行FQ-PCR分类鉴定。进化树分析结果表明，16S(18～28S)rDNA可作为细菌、衣原体、支原体及真菌快速分类鉴定的理想靶基因。FQ-PCR检测结果显示，通过细菌16SrDNAs通用引物和不同的特异引物，能够实现对各微生物样品的快速分类鉴定，检测灵敏度约2～5pg/μl的总DNA或(2×103±3×102)拷贝数的16SrDNA，并且该方法具有很强的特异性。

目录

独创性声明及学位论文使用授权书声明

英文缩略词表

第一部分Mtb毒力基因mce1a的表达特性、克隆及原核表达

第二部分Mce1a基因在体外培养细胞中的RNAi实验研究及Mce1A蛋白介导的侵袭性作用机制

第三部分微生物16S rDNAs FQ-PCR快速分类与鉴定

参考文献

综述：“拉链(zipper）”与“触发（trigger）”——细菌侵袭的分子机制

致 谢

附 录