骨髓间充质干细胞在胰腺生理更新和病理再生中的作用

摘要

一、大鼠及小鼠轻症和重症急性胰腺炎模型的建立 目的：制作雨蛙素诱导的大鼠和小鼠轻症急性胰腺炎(MAP)模型及L-精氨酸诱导的大鼠和小鼠重症急性胰腺炎(SAP)模型，并对两个模型进行动态观察。 方法：皮下注射雨蛙肽制备大鼠和小鼠MAP模型；腹腔注射L-精氨酸制备大鼠和小鼠SAP模型。光镜下观察胰腺、肝脏、肠道和肺脏组织学变化，采用酶法测定血清淀粉酶的变化。 结果：在采集的受体7个组织器官中，均有239bp处的Sry基因，两组的阳性率均为100％。 结论：MSC在生理和病理情况下，可以迁移并分布于小鼠的胰腺及其他主要组织器官中。 三、骨髓间充质干细胞在胰腺生理更新和病理再生中的作用目的：探讨骨髓间充质干细胞在胰腺生理更新和病理再生中的作用。 方法：将60只体重180～220gSprague-Dawley(SD)大鼠随机分为5组，每组12只。A组为正常阴性对照组，不作任何处理；B组为自体骨髓回输对照组，C组为雨蛙肽致轻症胰腺炎(MAP)模型组，D组为L-精氨酸致重症胰腺炎(SAP)模型组，E组为粒细胞集落因子(G-CSF)预处理组(SAP+GSF)：在造模前3d,scG-CSF40μg/(kg·d)，共3d，其余处理同D组。造模前3d用核染料Hoechst33258标记自体骨髓间充质干细胞(MSC)，并回输到自体骨髓腔。于骨髓干细胞回输后的2wk和8wk，分批处死大鼠，采集胰腺，立即进行冰冻切片，荧光显微镜下直接观察胰腺组织中是否有呈现黄绿色荧光的细胞，选择有上述有黄绿色荧光的冰冻切片进行免疫荧光染色，观察有无Cytokeratin19、胰岛素和胰高血糖素染色呈阳性的细胞。 结果：A组的胰腺冰冻切片未见有黄绿色荧光。造模后2wk，B、C、E和D组存活大鼠可见标记的MSC出现在正常胰腺组织和损伤胰腺组织中，在正常胰腺组织中偶见，而在损伤胰腺组织中多见，尤以GSF预处理组最多见，C、D、E组一直持续到8wk仍可见到黄绿色荧光。A和D组死亡大鼠未见Cytokeratin19、胰岛素和胰高血糖素染色呈阳性的细胞。造模后2wk，B、C、E和D组存活大鼠掺入损伤胰腺中的MSC均有分化为Cytokeratin19染色阳性的细胞，未见胰岛素和胰高血糖素染色呈阳性的细胞。造模后8wk，胰岛素和胰高血糖素染色呈阳性的细胞在C、D组偶见，E组散见。 结论：骨髓间充质干细胞在自然情况下，参与胰腺的生理更新和损伤修复。生理情况下，胰腺更新少、慢，主要由胰腺干细胞补充，病理损伤时，自体骨髓干细胞可随血液循环到达损伤的胰腺，转化为胰腺干细胞，最终进入增殖和分化程序，成为成熟的胰腺细胞，参与胰腺病理修复。 四、骨髓间充质干细胞在早期重症急性胰腺炎并发多脏器功能障碍综合征中的作用目的：探讨骨髓间充质干细胞在早期重症急性胰腺炎并发多脏器功能障碍综合征中的作用。 方法：将50只体重180～220gSprague-Dawley(SD)雌性大鼠随机分为5组，每组10只。A组为正常对照组，不作任何处理，B组为L-精氨酸致早期重症胰腺炎(ESAP)模型组，C组为自体骨髓回输对照组，造模后1d用核染料Hoechst33258标记自体骨髓间充质干细胞(MSC)，并回输到自体骨髓腔，其余处理同B组。D组为异体骨髓移植组，在造模前3d通过尾静脉移植雄性MSC，E组为粒细胞集落因子(G-CSF)预处理组(ESAP+GSF)：造模前3d用核染料Hoechst33258标记自体骨髓间充质干细胞(MSC)，并回输到自体骨髓腔，在造模前3d，scG-CSF40μg/(kg·d)，共3d，其余处理同B组。复制SAP模型后72h处死大鼠，解剖，观察大体组织形态，包括胰腺及肝脏、肠道，一部分组织立即进行冰冻切片，荧光显微镜下观察组织中有否荧光标记的MSC出现。选择有荧光的切片，进行相应组织的免疫荧光染色。对胰腺、肝脏切片进行CK19免疫荧光染色，以观察其是否分化为胰腺干细胞和肝脏干细胞。对肠道切片进行PanCytokeratin免疫荧光染色，以观察MSC是否分化为肠上皮细胞；另一部分组织常规石蜡包埋，切片后HE染色后，光镜下观察胰腺、肝脏、肠道组织学改变。记录造模后72h内的死亡率。 结果：①72h死亡率，A组为0，B组和C组为40％，E组和D组为10％。 ②病理损伤情况：大体观察：A组为正常的组织结构状态。B、C组在造模后72h胰腺坏死，胰周脂肪皂化，出现大量血性腹水，在死亡的大鼠中，可见肝脏、肠、肺等多脏器受累、坏死。D、E组大鼠肉眼可见腹水量明显减少，胰腺轻度水肿，无出血坏死灶。光镜观察：A组胰腺组织结构清晰，腺泡小叶完整，间质无渗出，B组、C组在造模后72h，胰腺大片凝固性坏死，结构模糊，炎性细胞浸润，D、E组胰腺腺体小叶结构基本清晰，出血坏死减轻，间质中炎性细胞浸润较轻。A组肝脏小叶结构正常，B、C组肝细胞变性，灶状坏死，D、E组肝细胞轻度肿胀，少量炎性细胞浸润；A组大鼠肠黏膜腺体结构清楚，B、C组大鼠肠黏膜腺体紊乱，炎性细胞浸润，D、E组肠黏膜炎性细胞浸润明显减轻。③荧光染色情况：A、B组的胰腺、肝脏、肠道冰冻切片未见有黄绿色荧光，C组切片中偶见黄绿色荧光，但胰腺、肝脏切片未见CK19免疫荧光染色阳性细胞，肠道切片未见PanCytokeratin免疫荧光染色阳性细胞；D组和E组切片黄绿色荧光多见，且胰腺、肝脏切片中可见CK19免疫荧光染色阳性细胞，肠道切片中可见PanCytokeratin免疫荧光染色阳性细胞。 结论：骨髓间充质干细胞参与早期重症急性胰腺炎并发肝脏、肠损伤时的病理修复，并可分化为肝卵圆细胞和肠上皮细胞，异体MSC移植和自体MSC动员对早期重症急性胰腺炎并发多脏器功能障碍综合征有保护作用。 总结：雨蛙素诱导的大鼠及小鼠MAP模型和L-精氨酸诱导的大鼠及SAP模型轻重不同，简便、可靠、重复性及可比性好，适合AP的发病机制和治疗学的研究。异体移植的骨髓间充质干细胞在生理和病理(轻症急性胰腺炎)情况下，可以迁移并分布于小鼠的胰腺及其他主要组织器官中。骨髓间充质干细胞在自然情况下，可以参与胰腺的生理更新和损伤修复。生理情况下，胰腺更新少、慢，主要由胰腺干细胞补充，病理损伤时，自体骨髓干细胞可随血液循环到达损伤的胰腺，转化为胰腺干细胞，最终进入增殖和分化程序，成为成熟的胰腺干细胞，参与胰腺损伤修复。骨髓间充质干细胞参与早期重症急性胰腺炎并发肝脏、肠损伤时的病理修复，并可分化为肝卵圆细胞和肠上皮细胞，异体MSC移植和自体MSC动员对早期重症急性胰腺炎并发多脏器功能障碍综合征有保护作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语表

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前言

第一部分大鼠及小鼠轻症和重症急性胰腺炎模型的建立

实验一大鼠轻症和重症急性胰腺炎模型的制备

实验二小鼠轻症和重症急性胰腺炎模型的制备

图表1

图表2

参考文献

第二部分骨髓间充质干细胞在生理和病理条件下迁移并分布于胰腺及其他组织器官的研究

第三部分骨髓间充质干细胞在胰腺生理更新和病理再生中的作用

第四部分骨髓间充质干细胞在早期重症急性胰腺炎并发多脏器功能障碍综合征中的作用

1材料

2方法

3结果

4讨论

图片1

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参考文献

全文总结

综述一 干细胞与胰腺疾病

综述二 胰腺干细胞和祖细胞的鉴定与扩增

致谢

博士期间主编专著、发表文章情况