α-黑素细胞刺激素对人外周血T淋巴细胞增殖的抑制作用及其机制初探

摘要

α-黑素细胞刺激素(α-Melanocyte-stimulatinghormone，α-MSH)是一种由13个氨基酸构成的神经肽，由阿黑皮素原(proopiomelanocortin，POMC)经特异蛋白酶裂解而形成，在脑、腺垂体、皮肤及炎症局部等部位有较高的分布。α-MSH具有退热、抗炎、抑制摄食、保护细胞抗紫外线损伤和免疫调节等作用。α-MSH能结合五种型别的黑皮质素受体，这些受体在机体广泛分布，其中包括胸腺、单核/巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞、内皮细胞等免疫器官和免疫细胞。α-MSH对实验性自身免疫性疾病、移植排斥反应、实验性致死性内毒素血症、急性呼吸窘迫综合征等多种炎症性疾病的实验动物有显著保护作用。至今未发现其有蓄积毒性，显示出具有广阔的应用前景。 T淋巴细胞在介导细胞免疫应答和辅助体液免疫应答中起着关键作用。已有实验表明，α-MSH对T细胞介导的一些自身免疫性疾病和移植排斥反应均起着有益的调节作用。因此，我们推测α-MSH能直接调节T细胞的功能。本实验室以往的工作已经发现在人永生性T淋巴细胞株Jurkat细胞上存在能与α-MSH特异性结合的受体，并且可以抑制植物凝血素(PHA)刺激引起的Jurkat细胞增殖反应。在此基础上，本课题研究了α-MSH对PHA活化的人外周血T淋巴细胞是否也有增殖抑制作用，并且对其作用机制进行了初步探讨。 首先我们证实了α-MSH对体外培养的PHA刺激的健康人外周血T淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，当α-MSH的终浓度为1×10-7mol/L时抑制作用最强。为了阐明α-MSH对PHA刺激T细胞增殖的抑制作用机制，我们用流式细胞仪进行了细胞周期分析。结果发现，与仅用PHA刺激的对照组相比，α-MSH+PHA作用后，人外周血T细胞G1期比例明显增多，相同浓度的α-MSH类似物NDP-MSH也具有同样的作用，但抑制作用稍强于α-MSH，提示细胞周期阻滞发生在G1期。通过PI标记，我们进一步利用流式细胞仪分析了α-MSH对PHA刺激的T淋巴细胞晚期凋亡的影响。结果显示，α-MSH能抑制PHA刺激的T淋巴细胞发生凋亡。用ELISA法检测培养细胞上清中细胞因子水平表明，终浓度为1×10-7mol/L的α-MSH作用于PHA刺激的T细胞后，上清中IL-2、TNF-α水平明显降低，IFN-γ表达水平明显升高；而作用于SEB刺激的T细胞后，上清中IL-2水平也显著降低。 由于细胞周期是通过包括细胞周期蛋白(cyclin)、周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)和周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(CKI)等在内的一个复杂网络进行调节，本实验采用WesternBlotting检测了与细胞周期调控有关的蛋白表达水平。结果发现，终浓度为1×10-7mol/L的α-MSH作用于PHA刺激的T淋巴细胞后，周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p27的表达水平升高，cyclinE的表达水平降低。这提示α-MSH通过上调或下调一些细胞周期相关蛋白的表达导致细胞周期限制在G1期。进一步用二维电泳方法和硝酸银染色以及差异表达蛋白质点的质谱分析技术，对差异蛋白质斑点中表达明显上调的2个斑点做肽指纹图谱分析，在蛋白质数据库MSDB(www.matrix.science.com)中比对质谱得到的肽序列标签，发现与之匹配的蛋白质为原肌球蛋白(tropomyosin)和锌指蛋白585A(zincfingerprotein585A)。提示上调原肌球蛋白和锌指蛋白585A的表达与α-MSH抑制PHA活化的T细胞增殖有关。 综上所述，α-MSH对PHA活化的人外周血T细胞增殖有抑制作用，使细胞周期停滞于G1期，这种抑制作用与细胞周期相关蛋白p27表达水平上调和cyclinE表达水平下调有关，也与原肌球蛋白异构体和锌指蛋白585A表达量增加以及相关细胞因子表达水平变化有关。此外，α-MSH还对PHA活化的人外周血T细胞凋亡有抑制作用，提示α-MSH对T淋巴细胞的“兴奋”或活化起调节作用，从而对机体的免疫系统起到稳定作用。这些研究结果有助于阐明α-MSH的免疫调节机制，并为进一步研究α-MSH用于预防和治疗T细胞介导的炎症损伤提供了新的实验依据。

目录

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前 言

1材料与方法

2实验结果

3.讨论

小 结

参考文献

Cyclin E的研究进展（文献综述）

致 谢

硕士研究生答辩后上交材料清单