枯草芽孢杆菌产抗菌环状脂肽的研究

摘要

为了农业可持续发展和环境保护的需要，植物的生物防治受到越来越多的关注。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是一类广泛分布于土壤和植物表面的嗜热性内生芽孢细菌，能产生多种抗菌物质，抑制多种病原真菌生长，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，是一种理想的生防微生物，其中有一些已经商业化并应用于植物病虫害防治领域。
　　 本研究分离了一株对小麦赤霉炳菌有抑制作用的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis JA。报道了利用离子束生物技术改良出发菌菌株，提高出发菌株的抗菌活性，并成功分离到一株抗菌能力提高的突变株B.subtilis JA026。围绕该菌株抗菌活性物质进行研究，经过DEAE-Sepharose FF、SOURCE15 PHE和反相HPLC多步柱层析分离纯化后得到分子量在1400～1500Da左右的几种不同的主要抗菌物质。氨基酸组成分析表明有十个氨基酸组成，运用电喷雾电离串联质谱(ESI-MS/MS)结合氨基酸组成分析完成了对抗菌物质的鉴定和结构测定，证明它们是属于fengycin家族的环状脂肽，由10个氨基酸(其中8个构成一个环肽)和一个脂肪酸侧链构成。本文提出一种基于串联质谱技术的对枯草芽孢杆菌表达的这一类抗菌环状脂肽的快速分离纯化方法。
　　 本文分析了抗菌物质的抗菌特性，离体生物测定试验结果表明Bacillussubtilis JA026具有广谱的抗菌抑菌作用，不但对多种植物病原真菌，如水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)、小麦赤霉病(Gibberellazeae)、西瓜枯萎病(Fusariulmoxysporumfsp.Vasinfectum)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporum niveum)、辣椒炭疽病(Colletotrichum capsici)、油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)和果实采摘后病害柑橘青霉病(Penicillium italicum)等具有强烈抑制作用，而且对番茄青枯病(tobacco bacterial wilt)和烟草青枯病(tomato bacterial wilt)等植物病原细菌有抑制作用，另外对人类脚气病致病真菌红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)和须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)也有很好的抑制效果。发酵产物的活体生物测定试验表明其对黄瓜幼苗的灰霉病菌(Botrytis cinerea)和菌核病菌(Colletorichum gloeosporioides)的抑制作用，发酵液即使稀释4倍仍有效果，对桃树流胶病也有明显的抑制效果。大田的初期试验结果表明用Bacillussubtilis JA026发酵液浸种和田间喷洒，测定农艺性状的结果显示了其对小麦的株高、分蘖数和穗长的促进作用，并且有一定的增产效果。CCD显微镜图片显示抑制植物病原真菌生长的抗菌环状脂肽的抗菌作用：导致病原菌孢子和菌丝体畸形，抑制孢子萌发，菌丝体生长点产生大量泡囊，后期能使菌丝发生断裂、解体，细胞质消解等。本文报道的枯草芽孢杆菌JA026具有抑制植物病害和促进植物生长的能力，其抗逆性强，对环境友好，对人畜高度安全，因而在生物防治植物病害方面显示出很好的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

第1章 引言

第1节 植物生物防治研究综述

1.1 植物病害的生物防治

1.2离子束生物工程发展概况

第2节 论文研究内容

2.1 本论文的研究背景、目的与意义

2.2 本论文的主要研究目标与研究内容

第2章 离子注入选育高抗菌株

第1节 材料与方法

1.1 供试菌种

1.2 培养基

1.3培养条件

1.4离子注入处理方法

1.5拮抗能力测定

1.6 正负突变率的计算

1.7 出发菌株与高抗菌株株主要抗菌活性物质的比较

第2节 结果与分析

2.1 N+注入能量与Bacillus subtilis JA存活率的关系

2.2 N+注入剂量与Bacillus subtilis JA存活率的关系

2.3 N+离子注入剂量与正负突变率的关系

2.4 出发菌株和高抗菌株发酵曲线的比较

2.5 出发菌株和高抗菌株主要抗菌活性物质的比较

第3节 小结

第3章 枯草芽孢杆菌环状脂肽的分离纯化

第1节 材料和方法

1.1 供试菌株

1.2 粗提液的制备

1.3 粗提液稳定性的测定

1.4 抗菌环状脂肽的分离纯化

1.5 抗菌环状脂肽的分子量测定

1.6 抗菌环状脂肽的氨基酸组成分析

1.7 电喷雾电离串联质谱分析(ESI-MS/MS)

第2节 结果和分析

2.1 粗提液的稳定性

2.2 抗菌环状脂肽的分离纯化

2.3 抗菌活性物质的分子量测定

2.4 抗菌活性物质抑菌活性的测定

2.5 抗菌环状脂肽的氨基酸组成分析

2.6 抗菌环状脂肽的结构分析

第3节 小结

第4章 Bacillus subtilis JA026应用于生物防治的初步研究

第1节 对植物病害的防治

1.1 离体生测

1.2 CCD显微镜观察抑菌显微特征

1.3 与乳酸配合抑制黄曲霉生长

1.4 活体生物测定

1.5 结果与分析

第2节 小麦促生长作用的初步研究

2.1 材料和方法

2.2 结果和分析

第3节 小结

第5章 总结与讨论

1.1 主要研究结果

1.2 研究前景

参考文献

发表论文

专利申请

附录

致谢