死亡受体及配体中反义同源盒序列的筛选、鉴定及活性研究

摘要

目前，已有越来越多的证据表明，由DNA模板链(有义链)编码的(有义肽)和DNA互补链(反义链)编码的肽(反义肽)之间可发生特定的相互作用。并且这种相互作用的基础是有义氨基酸和反义氨基酸间的特定相互作用。另外，很早就有人对蛋白质内部和相互作用的蛋白质间的反义同源盒现象研究，发现其数量比统计学意义上多的多。在这些研究的基础上，Miller et al于2002年提出了蛋白质密码理论，其核心内容是指：蛋白质相互作用的信息存储于编码蛋白质的核苷酸序列中，编码一个蛋白特定片段的反义核苷酸序列，是编码另一与之相互作用蛋白的有义核苷酸序列。根据该理论，国外已经有人编写了相应的生物信息学软件，在IL-1、IL-18、C5a过敏毒素、Fas配体中找到能与其受体作用的反义多肽。 死亡受体 (Death Receptor，DR) 属于肿瘤坏死因子受体家族成员 (TNFreceptor superfamily，TNFRSF) 中的第二大类成员。包括：TNFRI、Fas、DR3、DR4、DR5、DR6等。其共同的特征：胞外含有一个富含半胱氨酸区域(cysteine-richdomain，CRD)，胞内含有称为死亡结构域(Death domain，DD)的特殊区域。与死亡受体相互作用的配体 TNFα、TRAIL、FasL、LTα、LTβ等属于肿瘤坏死因子家族成员。死亡受体与相应配体结合后，胞内的死亡结构域被激活，从而向细胞内传递死亡信号。 蛋白质密码理论的提出和已从某些配体中找到能与其受体作用的反义多肽的实践提示，编写有关生物信息学软件，使用该软件从死亡受体和它们的配体中，根据反义同源盒的配对原理，筛选可和其相对应的蛋白相互作用的反义功能多肽，用这些活性多肽与配体和受体结合，影响肿瘤细胞的凋亡行为，这是一个在抗肿瘤研究领域内值得探讨的问题。 内皮单核活化多肽－2(Endothelial monocyte-activming peptide-Ⅱ，EMAP-Ⅱ)是正在凋亡的或应激状态下的某些细胞生成和释放的一种前炎症细胞因子。近几年来的研究发现，它具有促凝血，抗血管生成，促淋巴细胞凋亡和增强细胞对TNFα敏感性等多种生物活性作用。体外和体内还实验发现，EMAP-Ⅱ可使肿瘤体积缩小，肿瘤组织内血管内皮细胞凋亡和抑制增殖。这些结果提示，EMAP-Ⅱ可能是在抗肿瘤治疗方面，一个有应用前景的细胞因子。但是，有关重组人EMAP-Ⅱ以及其对肿瘤细胞的促凋亡作用，尚未见有系统的报道。 本课题第一部分以蛋白质密码理论为理论出发点，编写氨基酸序列比对软件。以死亡受体 TNFR1、DR5及其配体TNFα、TRAIL 为筛选对象，通过软件筛选及理论分析相结合的方法，选择并合成几条受体和配体来源的反义同源盒多肽，对这些多肽开展包括ELISA结合实验、多肽细胞学实验等多方面的研究。 本课题的第二部分，我们从肝细胞cDNA文库中扩增EMAP-Ⅱ(147-312)编码序列，用pMAL 表达系统重组表达了人内皮单核活化多肽－2 (Endothelialmonocyte-activating peptide-Ⅱ，EMAP-Ⅱ)，对其生物学活性展开初步的研究。 一、反义同源盒序列的软件筛选、理论分析及合成首先，我们编写了氨基酸序列比对软件。本软件的正式名称：基于蛋白质密码原理筛选和分析功能多肽的应用软件2.0，中文简称：多肽筛选及分析2.0；属于科学研究事业自然科学类生物信息学应用软件，软件分类号：61000-9000。目前开发的为其正式版V2.0。该软件是基于蛋白质密码理论为用户提供在两条给定的氨基酸序列找出有一定相关匹配度片段的方法，支持直接从网页或其他文档中导入符合规范格式的氨基酸序列。可设置比对参数，比对结果显示于即时窗口，结果可以RTF文档保存。 通过该软件，我们分别以相互作用的TNFα和TNFRI、TRAIL 和DR5为序列Ⅰ和序列Ⅱ导入进行筛选。筛选时以一定长度内(10个氨基酸左右)匹配度大余70％为筛选条件。在软件筛选的基础上，我们对这些反义同源盒序列进行理论上的初步分析。选择并合成了TNFα来源的、TNFRI来源的、TRAIL来源的、DR5来源的共10条多肽。 二、合成多肽的活性研究在合成的多肽中有三条为TNFα来源的，三条为TNFRI来源的、两条TRAIL来源的、两条为DR5来源的。首先，我们进行多肽与目标蛋白的ELISA结合实验。在EUSA实验中，我们找到一条TNFRI来源的多肽LV-7能与 TNFα结合。一条DR5来源的多肽FR-11能够与TRAIL发生结合。 随后，我们对多肽开展了细胞生物学研究。细胞学实验包括多肽介导肿瘤细胞凋亡实验；多肽抑制配体杀伤肿瘤细胞实验；多肽抑制肿瘤细胞增殖实验等。其中，DR5来源的FR-11肽能够对TRAIL杀伤SWl990细胞产生一定的抑制效果。在高浓度 TRAIL 作用条件下，抑制作用并不显著。而在低浓度 TRAIL 条件下，则表现为比较明显的抑制作用。在 1.5μg/ml放线菌素D、500 ng/ml TRAIL作用条件下，100μg/ml的FR-11肽对TRAIL 促 SW1990细胞凋亡抑制率达到30％。随后，我们固定了 TRAIL 的作用浓度，而改变 FR-11 肽的作用浓度。发现：随着FR-11肽浓度的提高，其对凋亡的抑制作用也明显加强了。流式细胞术的实验结果也同样说明了这一点。接下来，我们对凋亡早期信号分子caspase-9的活性进行了定量检测。发现，在凋亡早期，加入FR-11肽能够很明显抑制caspase-9的活性。我们检测了不同时间段的caspase-9活性。发现，在凋亡早期，caspase-9的活性差异是显著的，随着时间的延长，这种差异会逐渐变小。可能的原因：多肽在细胞培养基中已经逐步降解。 三、重组人EMAP-Ⅱ的克隆、表达、纯化及初步活性研究作为本课题相对独立的部分，我们重组表达了人的EMAP-Ⅱ细胞因子。首先，我们设计相应的引物从人肝细胞cDNA文库中将EMAP-Ⅱ的编码序列扩增出来。经EcoRI和BamHl限制性内切酶双酶切与经过同样双酶切的pMAL质粒进行连接，将重组质粒转化入大肠杆菌表达型菌株BL-21。经过重组子的鉴定，挑选出其中正确的克隆采用pMAL原核表达系统对其进行表达，将表达产物进行纯化。将纯化好的MBP-EMAP-Ⅱ用Xa因子进行切割，用MCF-7细胞检测其生物学活性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

声明

前言

第一部分：死亡受体及配体中功能性反义同源盒序列筛选、合成及活性研究

一、实验材料、试剂、主要仪器设备

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二部分：重组人EMAP-Ⅱ的克隆、表达及初步活性分析

一、实验材料、试剂

二、实验方法

三、结果

四、讨论

全文总结

参考文献

致谢

综述：内皮-单核激活多肽Ⅱ(EMAP-Ⅱ)及其生物学功能

附录