联苯双酯调控细胞色素P450同工酶保肝机制的研究

摘要

联苯双酯(bifendate,DDB)是合成五味子丙素的中间体之一,为我国首创的治疗迁慢性肝炎药物。实验表明,DDB不仅有明显的降低血清谷丙转氨酶(ALT)作用,对化学性肝脏损伤亦有明显的保护作用。临床上,该药对病毒性肝炎病人ALT有迅速明显的降低作用,为治疗慢性肝炎的有效药物,现已经在肝病治疗中广泛应用。 细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)是肝药酶中重要的酶系,主要存在于肝微粒体内,参与各种外源物(如药物、化学毒物、致癌物等)和内源物(如类固醇激素、Vit.D、胆酸等)在体内代谢过程。机体90％以上的药物代谢都要通过肝微粒体酶的细胞色素P450,P450中现已知有70多种药物代谢酶分别催化不同物质的生物转化,在药物代谢和免疫中均起着相当重要的作用。在药物代谢过程中,往往存在一种CYP亚族参与多个药物代谢、一种药物由多个CYP亚族催化药物的现象。同时,许多药物既是某种药酶的底物,也可能是该种酶或其他酶的抑制剂和诱导剂,当多种药物联合用药时,有可能导致其中一种药物发生代谢障碍或加快代谢速度,使发生毒副反应或药物无效。 近年来随着细胞分离手段和分子生物学技术的不断进步,对CYPP450的研究也已进人分子水平。通过CYP的特性和表达分析,可以充分了解细胞色素P450在药物代谢中的作用,从而阐明药物的代谢机理和毒副反应。 在CYP450的测定中,酶活性的测定、蛋白免疫测定和mRNA的测定是我们比较了解和熟悉的方法。在上述三种方法中,其中蛋白免疫测定中,需要特定抗体；mRNA的测定中,如果蛋白的表达不完全依赖mRNA,那么用此方法测定的结果是不可靠的。酶活性的测定也会因为标记物质的交叉反应,带来不可信的结果。 随着人类基因组序列图绘制成功,生命科学进入了后基因组时代。蛋白质组(proteome)作为后基因计划中的一个很重要内容,已成为21世纪生命科学的热点领域。近年来,在大规模进行蛋白质组定性的基础上,研究人员已经将定量蛋白质组学提上了重要日程。定量蛋白质组学研究对于研究蛋白质组的功能、生命活动中蛋白质的相互作用网络以及药物靶标、疾病诊断标志物的发现具有重要意义。随着蛋白质组学研究的不断深入和发展,定量蛋白质组学已成为当前研究的热点。目前,定量蛋白质组学的研究方法包括两类：一类是基于双向电泳和图像分析的技术策略,另一类是基于同位素标记和质谱的定量方法。为了挖掘CYP450在肝损伤前后以及在药物治疗肝损伤前后的变化,本课题用酸酐标记技术与傅立叶转换离子回旋共振质谱(LTQ-FT)相结合,得到了一种新的定量蛋白质研究技术。通过建立的化学刺激(CCl4)肝损伤的动物模型,利用定量蛋白质组学的同位素标记法,比较处理前后的蛋白质组的表达差异、鉴定其中发生相应变化的蛋白质,从而揭示了疾病标记分子及药物靶向作用的代谢酶。从蛋白质分子水平上评价了联苯双酯对患病组织的修复治疗作用,通过联苯双酯治疗前后蛋白质组的表达差异,进一步阐明该类保肝药物的作用机理,为开发研究新药提供有利的依据。 第一部分研究首先从方法学上建立了适用于肝微粒体样品预处理方法,并优化SDS-PAGE分离蛋白质的胶内酶解与提取方案。密度梯度离心提取肝微粒体,对SDS-PAGE分离胶上蛋白质进行还原、烷基化等处理,选择适当的胶上酶切方法,作为该平台中联系凝胶电泳分离和质谱鉴定的桥梁,胶内酶解过程是影响肽段回收率的主要因素。实验考察了对胶上酶解过程中严重影响肽段回收率和蛋白质鉴定的确定性的诸多环节,酶解时间的长短、是否去盐等问题,优化了实验参数。酶解时间长(酶解过夜)有助于得到较多的肽段,胶上酶解所得的肽段是否去盐对质谱分析所得的谱图质量的影响,主要取决于肽段溶液中含盐量及溶液中肽段的相对多少等等。得到一种适用于分离CYP450蛋白质的SDS-PAGE的方法。 第二部分将SDS-PAGE分离与肽段乙酰基化标记有效结合起来,定量分析一个复杂的蛋白质组体系中的CYP450同工酶,弥补ICAT技术只针对含有巯基蛋白质的定量分析的不足。所建立的酸酐标记蛋白质分析方法,将胍基化反应与乙酰基反应相结合,提高了酰化效率,建立了新的蛋白质组同位素标记定量方法。分析了雄性大鼠肝微粒中CYP450同工酶。在CCL4刺激肝损伤的模型中共鉴定了17个CYP同工酶蛋白,定量结果发现,3个CYP450的同工酶表达上调,3个CYP450的同工酶表达下调。在联苯双酯预防肝损伤的模型中,共鉴定出16个CYP同工酶,在16个CYP450同工酶蛋白中,1个CYP450的同工酶上调,3个CYP450的同工酶蛋白下调。提示CCL4致肝脏肝细胞损伤与其中CYP2E1有直接的关系,同时,联苯双酯的保肝降酶作用也与此酶有关,并且找到联苯双酯解毒降酶的另一途径,即诱导CYP2B1。本工作首次将蛋白质组研究中的乙酸酐标记用于CYP450同工酶的定量分析,并确定了联苯双酯保肝作用中的代谢靶酶,充分阐明了生物学意义。因此,本课题的研究不仅为蛋白质组定量分析技术奠定了坚实的基础,而且开辟了研究药物作用机制以及药物代谢的广阔前景。

目录

论文说明：缩略词对照表

声明

第一章前言

第一节蛋白质组学的定量分析技术

第二节蛋白质组学在药学研究中的应用

第三节蛋白质组学的发展前景

第二章基于SDS-PAGE的细胞色素P450蛋白质的提取分离

第一节肝微粒体蛋白质的制备提取方法

1.研究背景

2. 实验材料

3.实验方法

第二节基于SDS-PAGE的细胞色素P450蛋白质的分离

1.研究背景

2.实验材料

3.实验方法

4.结果与讨论

本章小结

第三章联苯双酯保肝抑酶作用的研究

第一节CCL4致肝损伤的CYP450的变化

1.研究背景

2实验材料

3.实验方法

4.结果与讨论

第二节联苯双酯保肝的CYP450变化

1.研究背景

2.实验材料

3.实验方法

4.结果与讨论

本章小结

参考文献

在读期间发表文章

致谢