新型血小板冷冻保护剂的作用机理实验研究

摘要

近年来,随着成分输血的普及和推广,医学新技术开展和广泛应用,大剂量输血和疑难、复杂手术的增多,导致临床应用血小板数量急剧增加。新鲜液体血小板的及时供给性已远远不能满足临床需要,在我国血小板需求量大,往往不能及时保证供给,现采用的血小板常规保存方法(22℃液态震荡保存)仅为5～7天,且细菌污染机会增加,血小板功能下降,无法满足临床需要。冰冻保存的血小板具有良好的止血效果和升高血小板功效,副作用少,并具有安全、快捷、疗效好的特点,冰冻保存血小板既解决了临床输注血小板的需求,也为血小板保存方法的研究开辟了新途径。研究低温冰冻保存血小板技术对解决临床输注血小板难题是一大突破。 低温保存是目前细胞、组织长期维持生物活性的最理想保存方法之一,但低温保存的整个过程包括保护剂的选择、加入和移除、冷冻过程、复温过程、程序的选择,甚至保护剂本身对血小板也具有一定的毒性,可以激活血小板,造成血小板损伤,影响保存效果。血小板本身也具有易激活、寿命短、不稳定等性质,使冰冻保存血小板困难重重,尚有很多问题以待解决。 目前常规使用浓度为6％的二甲基亚砜(DMSO)作为血小板冷冻保护剂,但复温后血小板数量和功能均有所下降,而且更重要的是DMSO毒性呈剂量依赖性,在人体内的代谢产物有恶臭,理想的改良方法是在保证保存效果的前提下应尽量减低DMSO的浓度以减少其副作用。新型血小板冷冻保护剂采用低浓度DMSO(2％)和第二信使调节剂混合,通过可逆地作用于特异的活化通路抑制血小板体外激活、稳定血小板细胞内生化、减少血小板冻存损伤、减少DMSO的浓度,增强了血小板的活性,提高保存血小板的质量。 在前面的实验中使用新型血小板冷冻保护剂在-80℃条件下冰冻保存血小板,一周后复温并检测血小板的体外功能变化和血小板计数,发现新型血小板冷冻保护剂可以取得等同或稍低于6％浓度DMSO的保存效果。 在前面研究的基础上,为了解新型血小板冷冻保护剂的作用机理和获得血小板冰冻时的相关生物物理参数,本实验拟从低温生物物理学方面对新型血小板冷冻保护剂的作用机理作初步探讨。研究主要分为五个部分： 第一部分新型血小板冷冻保存剂的毒性实验研究 目的:检测预处理过程中新型血小板冷冻保护剂对血小板表面CD62p表达水平的影响,以探讨新型血小板冷冻保护剂对血小板激活的影响。 方法:全血采集后2h内以富含血小板血浆二次离心法制备浓缩血小板并分为四组：第-组,室温条件下加入新型血小板冷冻保护剂；第二组,4℃条件下加入新型血小板冷冻保护剂；第三组,室温条件下加入6％DMSO；第四组,4℃条件下加入6％DMSO。以新鲜血小板作为对照,流式细胞仪检测各组血小板表面CD62p在10min、20min、30min、40min、50min、60min的改变。 结果:各组组内血小板膜表面的CD62p表达不随时间的延长而增加,新鲜血小板对照组各时间点膜表面的CD62p表达与第一组、第二组横向比较无明显差异；第四组的CD62p表达高于第一组、第二组、新鲜血小板对照组,但低于第三组；第三组的CD62p表达明显高于其他各组。 结论：新型血小板冷冻保护剂对血小板无毒性,加入后在1h内进行冷冻保存对血小板表面CD62p的激活无明显影响。 第二部分降温速率对血小板冰冻保存质量影响的实验研究 目的：探讨新型血小板冷冻保护剂在不同降温速率下对血小板活性的影响。 方法：随机选择血站新鲜制备的浓缩血小板12个单位,留置部分新鲜对照,用新型血小板保护剂冰冻保存血小板,分别以1℃/min、10℃/min、20℃/min、非程序降温的方法降温至-80℃后直接转入深低温冰箱保存,冻存一周后复温检测其体外功能变化。 结果：复温后检测血小板计数结果为10℃/min组与1℃/min组、非程序降温组比较无统计学意义,均低于新鲜对照组,但都高于20℃/min组。肾上腺素诱导的最大聚集率结果为20℃/min组、1℃/min组、非程序降温组两两比较无明显差异,都比新鲜对照组显著降低,高于20℃/min组。与新鲜血小板相比,复温后的各组血小板表面CD41无明显变化。血小板表面CD42b的表达为,10℃/min组的CD42b的表达低于新鲜血小板对照组但无统计学意义,高于1℃/min组、、20℃/min组、非程序降温组的三组。血小板表面CD62p表达检测结果为冰冻血小板复温1℃/min组、20℃/min组、非程序降温组表面的CD62p的荧光强度高于新鲜血小板,其中10℃/min组的CD62p表达强度高于新鲜血小板对照组,但无统计学差别,和其他三组比较有统计学意义。 结论：使用新型血小板冷冻保护剂冰冻保存血小板时,以10℃/min进行程序降温的血小板复温后在各方面与新鲜血小板比较是最接近的,优于其他冷冻方式,因此,使用新型血小板冷冻保护剂低温保存血小板的最佳降温速率为10℃/min。 第三部分新型血小板冷冻保护剂热物性的实验研究 目的：积累血小板冻存时的相关低温物理参数,指导建立理想的血小板低温保存方法。 方法：采用DSC重复测量新型血小板冷冻保护剂和6％DMSO作为保护剂的血小板降温过程中的放热曲线。 结果：未加保护剂的血小板组的熔融相变温度分布于-1.02℃到-0.41℃之间,2％DMSO组的熔融相变温度分布于-1.86℃到-2.99℃之间,新型血小板冷冻保护剂组的熔融相变温度-3.78℃到-4.95℃之间,6％DMSO组的熔融相变温度-4.64℃到-5.72℃之间。新型血小板冷冻保护剂组、2％DMSO组和6％DMSO组的可冻水含量之间有显著区别,而新型血小板冷冻保护剂组的可冻水含量高于6％DMSO组,低于2％DMSO组。 结论：冷冻保护剂能够改变血小板的低温物理性质,新型血小板冷冻保护剂在改变血小板熔融相变温度和可冻水含量方面作用较好。 第四部分血小板低温保存过程中冰晶形成的低温显微研究 目的：利用低温显微镜对新型血小板冷冻保护剂作用下的浓缩血小板悬液的冰晶形成过程进行了显微观察,研究其冰晶形成规律。 方法：利用低温显微镜对新型血小板冷冻保护剂作用下的血小板的冰晶形成现象进行了显微研究。在微观尺寸上直接观察和摄入低温保存中冰晶在升降温中的变化。 结果：浓缩血小板在冰冻过程中,冰晶形态受保护剂类型和降温速率影响。冷却速度慢的情况下,形成的晶胚数量少,分支少而粗,胞内冰晶形成较晚,高速冷却情况下,晶胚形成数量多,最后形成细密的冰晶。新型血小板冷冻保护剂组较6％DMSO组形成的冰晶数目少,但形态粗大。 结论：浓缩血小板冰晶形成数量和形态受到不同冷冻保护剂和不同降温速率的影响。应选择合理的降温速率以提高保存效果。 第五部分冰冻血小板对系统血液免疫功能影响的实验研究 目的：利用现代系统免疫学理论与方法研究探讨使用新型血小板冷冻保护剂的冰冻血小板复温后对系统血液免疫功能的影响,为新型血小板冷冻保护剂的开发应用提供实验依据和理论基础。 方法：利用自然实验体系,研究冰冻血小板对系统血液免疫功能的影响进行分子水平的探讨,探讨冰冻血小板对血细胞表面相关免疫分子表达影响的变化规律。 结果：新鲜异体血小板组>新型血小板冷冻保护剂组>6％DMSO组>自体血小板组,血小板CD55表达水平自体血小板组(16.58±5.41)与新鲜异体血小板组(23.58±7.55)比较,结果具有统计学意义,但与其它两组的差异不明显,无统计学意义。血小板CD59表达水平,自体血小板组(18.76±4.33)与新鲜异体血小板组(24.39±6.68)比较,结果具有统计学意义；但与其它两组的差异不明显,无统计学意义。自体血小板组>新鲜异体血小板组>新型血小板冷冻保护剂组>6％DMSO组>贫血小板组,红细胞CD55表达水平,自体血小板组与贫血小板组比较有统计学意义,但与各实验组之间无统计学意义。自体血小板组的红细胞CD59表达水平与6％DMSO组、贫血小板组比较结果具统计学意义。白细胞CD25表达水平,自体血小板组(12.44±5.09)与新鲜异体血小板组(17.56±5.63)结果有统计学意义；但与其它各组的差异不明显,无统计学意义。 结论：本部分实验证实了血小板能够提高红细胞表面免疫分子的表达水平。通过比较研究发现,新鲜异体血小板对红细胞免疫反应性的抑制作用弱于冰冻血小板,对血小板、白细胞免疫反应性的激活作用强于冰冻血小板。冰冻血小板对系统免疫的影响和冷冻保护剂有一定关系,新型血小板冷冻保护剂作用下的冰冻血小板对系统血液免疫作用低于6％DMSO作用下的冰冻血小板。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

前言

第一部分新型血小板冷冻保存剂的毒性实验研究

一、材料和方法

(一)主要材料

(二)主要仪器

(三)方法

二、结果

(一)各组内比较

(二)各组间比较

三、讨论

第二部分降温速率对血小板冰冻保存质量影响的实验研究

一、材料和方法

(一)主要材料

(二)主要仪器

(三)方法

二、结果

(一)三种不同降温速率的降温曲线

(二)不同降温速率冷冻保存前后的血小板计数改变

(三)冷冻前后血小板聚集功能改变

(四)血小板表面CD41、CD42b的水平变化

(五)血小板表面CD62p的水平变化

三、讨论

第三部分新型血小板冷冻保护剂热物性的实验研究

一、材料和方法

(一)主要材料

(二)主要仪器

(三)方法

二、结果

三、讨论

第四部分血小板低温保存过程中冰晶形成的低温显微研究

一、材料和方法

(一)主要材料

(二)主要仪器

(三)方法

二、结果

(一)慢速冷冻和快速冷冻降温曲线

(二)不同冷冻保护剂作用下血小板胞内外冰晶形成图像

(三)使用6％DMSO作为冷冻保护剂,不同降温速率下血小板胞内外冰晶形成图像

(四)使用新型血小板冷冻保护剂时，不同降温速率下IIF图像

三、讨论

第五部分：冰冻血小板对系统血液免疫功能影响的实验研究

一、材料与方法

(一)主要材料

(二)主要仪器

(三)方法

二、结果

(一)血小板对系统血液天然免疫功能反应的影响

(二)异体血小板对系统血液天然免疫功能反应的影响

(三)灭活腹水癌细胞（S180）对系统血液天然免疫功能反应的影响

三、讨论

参考文献

小结

综述 低温冰冻保存血小板的研究进展

附录

致谢