基于代谢组学的胃癌化疗敏感性和毒性预测

摘要

目的： 化疗是治疗进展期胃癌的重要手段,但由于缺少指示化疗敏感性和毒性反应的标志物,胃癌化疗的选择性和针对性不强,使得其疗效一直不能令人满意,化疗相关的毒副作用也难以避免。如果在胃癌化疗前,通过某种检测方法筛选出对化疗敏感性高的胃癌患者,仅仅针对这一部分患者进行化疗,将无疑大大提高胃癌化疗的有效率,改善胃癌患者的预后。同时,对于化疗不敏感或化疗毒性反应大的胃癌患者,可以及时地调整、更换或补充相应的治疗方案,使这一部分患者有机会接受更加有效的替代方案,或避免化疗相关毒副作用的发生,提高生活质量。同时,这也将节约大量的医疗卫生资源,具有极其重要的经济和社会效益。有鉴于此,本研究结合我国胃癌高发的基本国情,以人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型为实验对象,观察荷瘤裸鼠对胃癌基础化疗方案DDP联合5-FU(PF方案)的化疗敏感性和毒性反应,通过建立的血浆代谢组学检测技术获得荷瘤裸鼠的血浆代谢谱,观察PF方案对荷瘤裸鼠代谢谱的影响,探讨PF方案治疗胃癌的机制,在代谢水平上研究胃癌化疗后出现不同化疗敏感性和毒性反应的原因,筛选可能具有胃癌化疗敏感性和毒性指示作用的代谢标志物,构建基于代谢组学的胃癌化疗敏感性和毒性预测模型,探索胃癌的个体化治疗策略。 方法： 取对数生长期的人胃癌MKN-45细胞株接种于BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下。当皮下移植瘤生长至直径1cm左右时,切取生长良好的肿瘤组织,剪切成直径约1.5mm的小块,接种至另一只裸小鼠皮下,如此传代5次以充分活化肿瘤细胞。取裸小鼠108只,以上述传代5次的皮下移植瘤为瘤源进行批量扩大造模,观察成瘤率。待大部分移植瘤体积接近100mm3时,剔除移植瘤生长不均匀的裸鼠,剩余80只荷瘤裸鼠随机分为PF干预组60只,NS对照组20只。剪耳法标记每只荷瘤裸鼠。眼眶静脉丛采血法采集每只荷瘤裸鼠血液150～200μl,离心制备血浆,以备代谢组学检测。采血后第2天正式给药,PF干预组予以腹腔注射DDP 4mg/kg,第1天,5-FU 20mg/kg/d,第2～6天。NS对照组予以腹腔注射NS,10ml/kg/d,第1～6天。密切观察荷瘤裸鼠给药后的反应,并每天测量每只荷瘤裸鼠的瘤径大小及体重,绘制肿瘤体积及体重变化曲线。 给药结束24小时后处死所有荷瘤裸鼠,摘除眼球取血,离心留取血浆,以备代谢组学检测。剥离每只荷瘤裸鼠的肿瘤组织称取瘤重,同时剪取心、肝、肺、肾等重要脏器,与肿瘤组织一起予以中性福尔马林固定保存,常规IE染色法进行肿瘤组织及心肝肺肾等重要脏器的组织病理学检查。以相对肿瘤体积作为PF方案化疗敏感性的分类标准,将PF干预组划分为高敏、中敏和低敏3组,比较各组间的化疗敏感性差异。以体重下降百分比作为PF方案化疗毒性的分类标准,将PF干预组划分为低毒、中毒和高毒3组,比较各组间的化疗毒性差异。考察PF方案的化疗敏感性与毒性之间是否具有相关性。 以Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱和Agilent 1200 RRLC/Agilent 6510 Q-TOF液质联用分析仪为平台,建立了基于液质联用(LC/MS)的血浆代谢组学检测方法,并对色谱的流动相条件以及质谱的干燥气流量、干燥气流温度、喷雾压力等实验条件分别进行了优化。利用该技术平台对采集的两个批次的血浆样品进行检测,以获得荷瘤裸鼠的血浆代谢谱。原始数据经标准化预处理后,对得到的多维数据集采用主成分分析(PCA)或偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)等特征提取算法,比较PF方案干预前后以及PF干预组与NS对照组的代谢谱差异,探讨PF方案对荷瘤裸鼠代谢谱的影响；比较PF方案干预后不同化疗敏感性和不同毒性亚组间的代谢谱差异,探讨PF方案产生不同化疗敏感性和毒性反应的代谢机制；比较PF方案干预前不同化疗敏感性和毒性亚组间的代谢谱差异,筛选可能具有PF方案化疗敏感性和毒性指示作用的代谢标志物。选取对胃癌化疗敏感性以及毒性各组间分类贡献最显著的前200个变量构建基于LC/MS血浆代谢组学的胃癌化疗敏感性和毒性预测模型。预测模型采用k最近邻法,采用10重交叉验证优化得到最近邻数后进行分类预测。分类预测采用两步预测。 计量资料采用-x±s表示,单因素两均数的比较采用t检验,多均数的比较采用方差分析,两个连续变量的相关分析采用非参数Spearman相关分析。P<0.05表示有统计学意义。统计分析和作图采用Microsott Office Excel 2003和SPSS 15.0软件包。代谢组学检测生成的代谢谱数据采用GeneSpring等软件包进行预处理,多元统计分析采用MATLAB软件包。 结果： 108只荷瘤裸鼠模型全部制作成功,造模1周后成瘤率为100％。造模2周后,大部分荷瘤裸鼠的皮下移植瘤体积接近100mm3左右,剔除移植瘤生长不均匀的裸鼠后,将剩余的80只荷瘤裸鼠随机分为PF干预组60只和NS对照组20只。两组在肿瘤体积、体重等方面的组间均衡性无差异。给药期间,60只PF干预组荷瘤裸鼠和20只NS对照组荷瘤裸鼠全部完成相应干预方案的治疗。但PF干预组中有1只荷瘤裸鼠在治疗结束后意外死亡。疗效分析显示PF干预组较NS对照组的相对肿瘤增殖率为59.6％,肿瘤生长抑制率为41.9％,均具有统计学意义(P<0.001),提示PF方案是治疗胃癌的有效方案。从PF干预第3天起,NS对照组的肿瘤体积和相对肿瘤体积逐渐大于PF干预组,而PF干预组的体重逐渐低于NS对照组。但不同的荷瘤裸鼠个体对PF方案的化疗敏感性和毒性反应存在很大差异。根据相对肿瘤体积的大小,将PF干预组划分为高敏组、中敏组和低敏组3组。PF干预组的相对肿瘤体积均低于NS对照组,且随着化疗敏感性的增高,相对肿瘤体积呈现逐级下降的趋势(P<0.001)。但NS对照组和PF低敏组之间无明显差异(P=0.392),而其它各组间均有明显差异(P<0.001)。不同组别的肿瘤组织病理学检查也表现出明显的抗肿瘤效应梯度趋势,与各组间的化疗敏感性梯度变化一致。根据体重下降百分比的不同,将PF干预组划分为低毒组、中毒组和高毒组3组。PF干预组的体重下降程度均重于NS对照组,且随着毒性的增高,体重下降程度呈现逐级加重的趋势(P<0.001)。但NS对照组和PF低毒组之间无明显差异(P=0.082),而其它各组间均有明显差异(P<0.001)。不同组别的心肝肺肾等重要脏器的组织病理学检查提示,PF方案干预后心肝肺均未见明显毒性。但肾脏组织的病理学检查结果提示PF方案的肾毒性呈现较为明显的梯度趋势,与各组间的化疗毒性梯度变化一致。相关分析显示PF方案的化疗敏感性与毒性呈负相关(r=-0.619,P<0.001),即化疗敏感性越高,毒性反应也就越重。 建立了稳定可靠的LC/MS血浆代谢组学检测技术,并利用该技术对实验中所采集的两个批次的血浆进行了检测。应用PLS-DA等特征提取算法进行数据分析发现,我们所建立的血浆代谢组学检测技术能够很好地反映荷瘤裸鼠微观代谢的变化以及不同组别之间的代谢谱差异,而且具有非常高的稳定性和可重复性。在此基础上,数据分析的结果提示PF方案能够显著增加荷瘤裸鼠血浆中的硬脂酰甘油磷酸胆碱、油酰甘油磷酸胆碱等胆碱类甘油磷脂的含量,同时明显降低苯丙氨酸、谷氨酸丁酰酯等氨基酸组分的含量,这些明显的代谢变化可能就是PF方案治疗胃癌的代谢机制。PF干预后不同化疗敏感性亚组间存在的差异代谢物与不同毒性亚组间存在的差异代谢物具有很高的相似性,都包括硬脂酰甘油磷酸胆碱、软脂酰溶血磷脂胆碱、亚油酰甘油磷酸胆碱、油酰甘油磷酸胆碱、亚油酰溶血卵磷脂、甲地孕酮、萘乙酸等。这些共同的代谢物质所在的代谢途径可能是PF方案化疗敏感性与毒性反应呈负相关的内在原因。可能具有PF方案化疗敏感性及毒性指示作用的代谢标志物包括亚油酰溶血卵磷脂、廿碳三烯酰甘油磷酸且日碱、维甲酸、乳糖酶基神经鞘氨醇、十七酰甘油磷酸胆碱、依托孕烯、硬脂酰甘油磷酸胆碱、十六酰甘油磷酸胆碱等。选取对化疗敏感性及毒性反应的组间分类影响最显著的200个代谢物通过k最近邻法建立胃癌的化疗敏感性和化疗毒性预测模型。其中,胃癌化疗敏感性预测模型的第一步预测正确率为91.7％,第二步预测正确率为88.9％,总预测正确率为83.3％。胃癌化疗毒性预测模型的第一步预测正确率为91.7％,第二步预测正确率为88.9％,总预测正确率为84.3％。 结论： 本研究首次将代谢组学引入到肿瘤的化疗敏感性和毒性预测研究中来,建立了稳定可靠的基于LC/MS的血浆代谢组学检测技术,发现PF方案治疗胃癌的机制主要与胆碱类甘油磷脂以及氨基酸的代谢有关,胃癌化疗敏感性与毒性反应相关的原因在于它们具有共同的代谢途径,初步筛选出亚油酰溶血卵磷脂、廿碳三烯酰甘油磷酸胆碱、十七酰甘油磷酸胆碱、硬脂酰甘油磷酸胆碱、十六酰甘油磷酸胆碱等具有胃癌化疗敏感性以及毒性指示作用的代谢标志物,并在此基础上构建了正确率分别为83.3％和84.3％的胃癌化疗敏感性及毒性预测模型,为下一步继续鉴定和验证这些胃癌化疗敏感性及毒性相关的代谢标志物,全面系统地阐释胃癌化疗敏感性和毒性发生的内在机制,推动胃癌个体化治疗的基础与临床研究提供了坚实的基础。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

中文详细摘要

英文详细摘要

前 言

第一部分PF方案对人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的疗效和毒性观察

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分基于LC/MS血浆代谢组学的胃癌化疗敏感性和毒性预测

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

小 结

创新点

参考文献

代谢组学及其在肿瘤研究中的应用

肿瘤化疗敏感性的研究进展

学习期间发表论文

致 谢