嗅鞘细胞与睫状神经营养因子在视神经损伤治疗中的协同作用

摘要

[目的] 视神经损伤后难以再生,至今尚未找到促进损伤视神经完全修复的方法。近来研究证明,嗅鞘细胞及睫状神经营养因子均可有效促进损伤神经修复再生。本研究首次将尚处于实验阶段的嗅鞘细胞移植术和已进入临床应用的睫状神经营养因子(CNTF)玻璃体内注射联合应用,以期达到更理想的治疗视神经损伤的效果,为临床救治视神经乃至中枢神经损伤提供新思路及实验依据。 [方法] 本研究应用该校神经生物学教研室的OECs原代培养技术,体外培养纯化OECs。然后建立成年SD大鼠视神经吸断伤模型：本实验采取经眶上缘暴露视神经的方法制作视神经吸断伤模型,将体外培养纯化的OECs植入球后视神经鞘膜下视神经轴突的吸断处,同时玻璃体内注射CNTF。按治疗手段不同,将实验大鼠分为对照组、CNTF组、OECs组和OECs+CNTF联合应用组。术后4w,采用霍乱毒素B亚单位(CTB)顺行示踪技术及荧光金(FG)、生物素化葡聚糖胺(BDA)逆行示踪技术评价OECs和CNTF对视网膜神经节细胞存活和视神经轴突再生的影响。通过计算视网膜上相同视野下视网膜神经节细胞即神经元的存活数、神经元的突起长度和密度进行方差分析和多元线性回归分析,评价OECs和CNTF对视网膜神经节细胞及其轴突的逆行性保护作用,比较OEgs、CNTF单独应用及联合应用对损伤视神经修复再生的影响,验证二者的协同作用。 [结果] 一、成功进行OECs体外原代培养和纯化 应用原代培养技术,并用差速贴壁、阿糖胞苷抑制和Forskolin.SPE营养物处理,从2.5月成年大鼠的嗅球分离、培养和纯化OECs。根据p75 NGFR免疫细胞荧光染色及Hoechst细胞核标记染色分析了所得细胞的纯度并对不同培养时期的细胞活性进行比较。成年大鼠来源的OECs纯化周期为10d,所得纯度可达95％以上,纯化后12-14d左右细胞活力开始下降。成年大鼠来源的OECs所得纯度较高,有利于进一步研究。 二、OECs和CNTF对大鼠视神经损伤后神经元的保护作用 建立成年SD大鼠视神经吸断伤模型,将体外培养纯化的OECs植入视神经吸断处鞘膜下,同时玻璃体注射CNTF。按治疗手段不同,将实验大鼠分为对照组、CNTF组、OECs组和OECs+CNTF联合应用组。4w后,通过计算视网膜上相应象限视网膜神经节细胞即神经元的存活数、神经元的突起长度和密度进行方差分析和线性回归分析,评价OECs和CNTF对视网膜神经节细胞及其轴突的逆行性保护作用。与正常眼大鼠视网膜神经节细胞数量相比,对照组损伤眼神经元明显减少。各治疗组视网膜神经节细胞存活数明显多于对照组,且神经元轴突长度及密度也均大于对照组。OECs组的视网膜神经节细胞存活数高于CNTF组,证明OECs保护视神经元作用强于CNTF。 三、OECs和CNTF在视神经损伤修复过程中具有协同作用 在观测、统计上述各视神经损伤指标时发现,与CNTF或OECs单用组相比,CNTF和OECs联合应用组对视神经损伤的修复作用最强。提示CNTF和IOECs在视神经损伤修复治疗中具有协同作用。 [结论]局部应用外源性OECs和玻璃体注射CNTF均能减轻视神经损伤引起的逆行性神经元损害,OECs保护视神经元的作用优于CNTF。OECs与CNTF联合应用保护视神经元效果更加显著,两者合用产生了协同作用。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘 要

前言

第一部分嗅鞘细胞的培养、纯化和增殖

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分嗅鞘细胞与睫状神经营养因子联合应用促进损伤视神经修复再生的实验研究

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

综述一：视神经再生与修复的实验研究进展

综述二：Vasohibin负反馈调节血管新生的研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致 谢