表皮膜蛋白1在人椎间盘髓核细胞中的作用

摘要

椎间盘发育和退变中的相关基因变化及机制知之甚少。我们先前的研究发现,EMP1在退变的椎间盘髓核组织中高表达；文献报道其同家族基因perp的敲除会导致马哈鱼的脊索发育异常；另一个同家族基因PMP22在骨肉瘤细胞中明显高表达；这些发现表明该家族基因很可能在椎间盘细胞发育和退变中发挥着重要的作用。目前为止还没有它们在人椎间盘细胞中功能的研究报道,深入研究这些基因对人椎间盘细胞的影响,将有助于了解椎间盘细胞发育和退变的机制。鉴于EMP1在退变的人椎间盘细胞中表达明显升高,我们选择EMP1作为研究对象。 一、EMP1对椎间盘发育的影响 为了研究EMP1对椎间盘发育的影响,我们培养了发育中的人胚(胎龄4个月左右)椎间盘髓核细胞,并分别构建EMP1的高表达慢病毒载体和干涉慢病毒载体。转染后半定量RT-PCR与western blot证明所建立的高表达EMP1和低表达EMP1的细胞模型成功。而后荧光倒置相差显微镜观察细胞形态变化；绘制细胞生长曲线观察细胞增殖情况；CCK8检测细胞活力；流式细胞仪检测细胞周期；贴壁培养或悬浮培养状态下观察细胞黏附能力；半定量RT-PCR检测细胞I型胶原、II型胶原的表达变化；在放线菌酮、十字孢碱作用或悬浮培养后流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果显示：高表达EMP-1后细胞的活力增强、增殖加快、周期进程改变、存活能力增强、形态变化显著,粘附能力减弱,细胞外基质合成改变,长期培养未出现肥大细胞；干涉EMP1基因后椎间盘细胞活力下降、增殖减慢、G0/G1期细胞减少、凋亡增加。 这些结果对于椎间盘组织发育的意义在于： 1、椎间盘发育过程中,腹部巩膜刀的细胞需要迁移至中间形成脊索周围管,这些细胞随后发生浓聚,产生细胞浓度的阶段性差异,浓度高的地方发育为椎间盘,低的地方形成椎体。在这些过程中,细胞需要克服相互之间的连接、抵抗迁移中细胞失去附着所导致的失巢凋亡,并把握迁移的方向。EMP1基因能减弱细胞间的黏附、提高细胞抗失巢凋亡的能力、同时增强细胞极性有助于细胞在迁移中把握方向。 2、椎间盘和椎骨都源于脊索和脊索周围的间充质祖细胞,随后都软骨化,形成透明样软骨。然而椎骨部分的软骨细胞似乎出现更快的分化进程,出现了软骨内成骨,即：软骨细胞进一步分化成熟,增殖停滞,体积肥大,分泌的基质改变,凋亡增加,最终软骨细胞消失,成骨细胞安家,软骨矿化为骨。EMP1似乎可以阻滞这一过程,当对照组的细胞出现类似上述的表现时,高表达EMP1的细胞依然增殖较快,没有出现肥大的细胞,凋亡较少,细胞外基质合成不同于对照组。说明EMP1可能在椎骨和椎间盘不同的发育方向选择上发挥了重要作用。 二、EMP1在退变椎间盘细胞中的作用 为了研究EMP1在退变椎间盘细胞中的作用,我们分离培养了成体退变椎间盘髓核细胞,转染干涉慢病毒后半定量RT-PCR与western blot验证干涉模型,荧光倒置相差显微镜检测细胞的形态变化；绘制细胞增长曲线检测细胞增殖；CCK8检测细胞活力；剥夺血清或放线菌酮作用后流式细胞检测细胞凋亡情况；半定量RT-PCR检测细胞Ⅰ型胶原表达。结果显示：干涉EMP1在成体退变椎间盘髓核细胞的表达后,细胞收缩变圆、增殖减慢、活力下降、凋亡增加、增殖期细胞比例降低、Ⅰ型胶原纤维表达下降。 这些结果的可能具有以下意义： 1、健康的椎间盘包括很少均匀、稀疏分布的细胞,然而退变椎间盘则会特征性的出现细胞簇,研究表明这些细胞具有较强增殖能力。我们之前发现退变的椎间盘组织高表达EMP1,本实验中敲减EMP1的表达,降低了退变髓核细胞的增殖能力,说明EMP1的高表达是导致退变椎间盘中细胞增殖增加的分子机制之一。 2、软骨细胞的形态与其表型密切相关的。许多研究结果显示软骨细胞圆形的状态可以更好的执行其功能。反之,扁的软骨细胞更倾向于去分化。我们发现干扰EMP1的表达,导致了椎间盘细胞的变圆,同时减少了作为退变标志之一的Ⅰ型胶原的表达。可见EMP1在提高细胞存活与增殖能力的同时也诱导了细胞的去分化。总之,我们的研究结果表明EMP1基因是椎间盘发育过程中的重要基因,EMP1基因的高表达是加速椎间盘退变的原因之一。

目录

论文说明：英文缩写表

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摘要

绪 言

第一部分人椎盘髓核细胞的分离、培养、扩增及鉴定

1前言

2材料和方法

2.1试剂和设备

2.2人胚椎间盘髓核细胞的分离、培养、扩增、鉴定

2.3人退变椎间盘髓核细胞的分离、培养、扩增、鉴定

3结果

3.1人胚椎间盘髓核细胞

3.2人退变椎间盘髓核细胞

4讨论

4.1培养的人胚椎间盘髓核细胞的细胞类型

4.2人胚椎间盘髓核细胞与成体椎间盘髓核细胞

参考文献

第二部分EMP1在人胚髓核细胞中的作用

1前言

2材料和方法

2.1试剂和仪器设备

2.2方法

3结果

3.1人胚椎间盘髓核细胞中EMP1的表达

3.2 EMP1低表达对椎间盘髓核细胞的影响

3.3 EMP1高表达对人胚椎间盘髓核细胞的影响

4讨论

4.1人胚NPCs的转染

4.2 EMP1与椎间盘的发育

4.3 EMP1与人胚NPCs的形态和增殖

4.4 EMP1与椎间盘细胞的分化

4.5 EMP1与细胞周期进程

参考文献

第三部分EMP1在退变椎间盘髓核细胞中的作用

1前言

2材料和方法

2.1退变椎间盘髓核细中EMP1的表达

2.2 EMP1干扰慢病毒的转染

2.3低表达细胞模型的鉴定

2.4 EMP1低表达对退变椎间盘髓核细胞的影响

3结果

3.1退变椎间盘髓核细胞中EMP1的表达

3.2低表达模型的鉴定

3.3.EMP1低表达对椎间盘髓核细胞的影响

4讨论

4.1 EMP1与退变椎间盘细胞的增殖及存活

4.2 EMP1诱导的细胞形态变化与椎间盘细胞的功能改变

参考文献

全文小结

创新点和意义

致谢

文献综述 EMP1基因的结构和功能

线粒体凋亡途径参与表皮膜蛋白1诱导的细胞凋亡