抗晕动鼻腔给药系统研究及其脑靶向评价

摘要

目前为止，临床最有效的抗晕动症药物之一 M受体阻滞剂东莨菪碱，口服生物利用度低，同时亦对中枢认知和操作功能有一定的副作用。本课题以组方中加入中枢兴奋药莫达非尼使药物在抗晕动的同时不产生嗜睡的副作用。抗晕动症药物普遍存在的问题是：①给药途径单一(口服或透皮)；②剂型上开发不足(仅限于片剂、胶囊和贴片等传统剂型)。本课题研究的复方抗晕动药鼻腔给药系统正是针对目前抗晕动药存在的问题而设计的。采取鼻腔给药的方式，可以提高东莨菪碱的生物利用度，降低给药剂量，使药物迅速达到靶向部位并避免首过效应，从而获得满意的抗晕动效果。 鼻腔嗅神经上皮是CNS与外界直接相接触的唯一组织。被鼻纤毛覆盖的嗅神经感觉神经元的轴突形成束，能够穿过筛板进入颅腔，并且与脑内嗅球的僧帽细胞和丛细胞形成突触连接，这是药物从鼻腔吸收入脑的嗅黏膜上皮通路。鼻腔给药后药物分子滞留于嗅部黏膜而易吸收进入脑脊液，因而可绕过BBB进入CNS，发挥治疗作用。然而，普通纳米粒鼻腔给药存在的问题是①由于受到鼻纤毛的清除，纳米粒在鼻腔中通常仅能滞留15～20min，因而往往尚未被完全摄取即被清除；②普通纳米粒在鼻黏膜上的吸收缺乏部位选择性：其可能通过呼吸部黏膜吸收增加药物进入血液循环，也可能通过嗅黏膜吸收增加药物入脑，因而脑靶向效率较差。 壳聚糖是由甲壳素脱乙酰而来，具有良好的生物相容性、可降解性和黏膜黏附性且价格低廉。由于壳聚糖分子中存在羟基和酰基，因此容易进行多种化学反应。本课题选用水溶性壳聚糖，制备了两种新型壳聚糖衍生物：L-精氨酸修饰的壳聚糖和多巴胺修饰的壳聚糖。L-精氨酸和多巴胺可分别与鼻腔嗅黏膜上NADPH黄递酶或多巴胺转运蛋白结合，由这两种材料制备的纳米粒，可延长给药系统在鼻黏膜，尤其是嗅黏膜上的滞留时间，增强鼻黏膜对给药系统的吸收，在降低给药剂量和不良反应的同时，提高脑靶向效率。L-精氨酸修饰的壳聚糖国内外报道较少，而且是用于基因转染，尚未有人用于脑靶向制剂研究中。多巴胺尚未见到有报道接枝于壳聚糖，我们成功地将多巴胺接枝于壳聚糖，并且接枝率达到10％以上。因此，本课题的研究具有一定的创新性。 本文第一部分以药效学指标筛选药物鼻用制剂剂量。我们通过建立了三种动物模型(抗晕动实验，开场实验，爬杆实验)，证明了东莨菪碱联合莫达非尼原料药鼻腔给药治疗晕动症的有效性。莫达非尼鼻腔给药罕有报道，本部分实验证明了莫达非尼鼻腔给药的有效性并得到了其鼻腔给药的有效剂量范围(0.3-3 mg/kg)，为下一步研制纳米粒给药系统奠定了基础。 本文第二部分为壳聚糖衍生物的构建和表征，选用水溶性壳聚糖(MW=3000)，构建了两种新的壳聚糖衍生物：L-精氨酸修饰的壳聚糖(arg-cs)和多巴胺修饰的壳聚糖(dopa-cs)。以EDC和NHS为偶联剂，对壳聚糖进行精氨酸化修饰；多巴胺与丁二酸酐偶联，然后接枝于壳聚糖进行多巴胺化修饰。通过红外，核磁及质谱对其结构进行表征，证实了壳聚糖表面接有L-精氨酸或多巴胺，接枝率分别为28％和10.7％。 第三部分制备壳聚糖及其衍生物纳米粒并对其进行表征。采用离子交联法制备三种纳米粒：壳聚糖纳米粒(cs-np)，L-精氨酸修饰的壳聚糖纳米粒(arg-cs-np)和多巴胺修饰的壳聚糖纳米粒(dopa-cs-np)。筛选优化制备工艺，确定三种壳聚糖与多聚磷酸钠(TPP)质量比均为20：1。所得纳米粒粒径＜100nm，Zeta电位＞30mv。原子力显微镜观察其外观圆整，大小均一，分散性好。 第四部分对三种壳聚糖纳米粒进行脑靶向性评价，选用香豆素-6作为荧光探针，制备了载香豆素-6的三种纳米粒。所得纳米粒粒径在100～120nm，Zeta电位＞30mv。原子力显微镜观察其外观圆整，大小均一，分散性好。采用柱分离法纯化纳米粒后，体外24h释放实验证实香豆素-6累积释放率为0，说明香豆素-6是一种较理想的荧光探针，可用于示踪纳米粒在大鼠体内的转运情况。纯化后的纳米粒经鼻腔给药后0.25，0.5，1，2，4，8，12，24h分别采集大脑、小脑、嗅球、血等器官和组织，用组织匀浆和液液萃取法处理样品，采用HPLC偶联荧光检测器测定了载香豆素-6的三种纳米粒鼻腔给药后大鼠血及脑组织中荧光探针浓度，评价其脑靶向效果。结果显示L-精氨酸修饰和多巴胺修饰的壳聚糖纳米粒显著增加包载于纳米粒中的香豆素-6经鼻给药后的入脑量：L-精氨酸修饰和多巴胺修饰的壳聚糖纳米粒组脑组织中香豆素-6平均峰浓度分别为壳聚糖纳米粒组的1.60和1.93倍，药时曲线下面积分别为壳聚糖纳米粒组的2.17和2.68倍。脑靶向指数(DTI)分别是未修饰组的2.99和6.90倍，三种纳米粒的脑靶向效率依次为dopa-cs-np＞arg-cs-np＞cs-np。 第五部分为载东莨菪碱壳聚糖及其衍生物纳米粒的制备及复方抗晕动药物药代动力学研究。首先制备了载东莨菪碱的三种壳聚糖纳米粒(方法同第三部分，壳聚糖与TPP质量比均为20：1)，所得纳米粒粒径＜200nm，Zeta电位＞30mv。原子力显微镜观察其外观圆整，大小均一，分散性好。测定东莨菪碱的包封率为10％左右。采用LC/MS对大鼠血及脑组织中东莨菪碱及莫达非尼进行含量测定，并评价其脑靶向效果。结果表明，包载于arg-cs-np和dopa-cs-np的东莨菪碱脑内平均Cmax分别为cs-np的1.26和1.02倍，AUC分别为cs-np的1.01和0.96倍。脑靶向指数(DTI)分别是未修饰组的1.12和1.45倍，三种纳米粒的脑靶向效率依次为dopa-cs-np＞arg-cs-np＞cs-np。 第六部分评价三种载东莨菪碱壳聚糖纳米粒的抗晕动效果，以药效学指标证实：arg-cs-np和dopa-cs-np组抗晕动效果优于cs-np组(P＜0.05)，这与其靶向效率dopa-cs-np＞arg-cs-np＞cs-np是一致的。 第七部分对三种壳聚糖纳米粒鼻腔给药的安全性进行评价。采用在体大鼠鼻黏膜模型和离体蟾蜍上颚黏膜模型，评价三种壳聚糖纳米粒对鼻黏膜纤毛的影响情况，结果显示：三种壳聚糖纳米粒对蟾蜍上颚黏膜纤毛运动持续时间影响较小，与生理盐水组阴性对照，纤毛持续运动时间百分率90％以上；对大鼠鼻黏膜纤毛形态影响小，持续给药7天后，大鼠鼻黏膜纤毛形态与生理盐水对照组相似，纤毛浓密，未出现明显脱落，说明三种壳聚糖纳米粒对鼻纤毛毒性小，证实该系统具有较高的安全性。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分复方抗晕动药经鼻给药的药效实验

1仪器与材料

1.1仪器

1.2药物与试剂

1.3实验动物

2实验方法

2.1药物溶液配制

2.2动物分组及给药方案

2.3抗晕动实验

2.4开场实验

2.5爬杆实验

2.6统计分析

3实验结果

3.1抗晕动实验

3.2开场实验

3.3爬杆实验

4讨论

4.1东莨菪碱联合莫达非尼的鼻腔给药途径

4.2抗晕动病模型的建立

4.3东莨菪碱与莫达非尼的作用机制

5小结

参考文献

第二部分壳聚糖衍生物的构建和表征

1仪器和材料

1.1仪器

1.2材料与试剂

2实验方法

2.1壳聚糖衍生物的合成与表征

2.2表征

3实验结果

3.1红外光谱

3.2核磁共振

3.3结合元素分析结果

3.4丁二酰多巴胺质谱图

4讨论

4.1关于接枝率的考虑

4.2活化试剂的选择

5小结

参考文献

第三部分壳聚糖及其衍生物纳米粒的制备和表征

1仪器和材料

1.1仪器

1.2材料与试剂

2实验方法

2.1壳聚糖及其衍生物纳米粒的制备

2.2壳聚糖及其衍生物纳米粒的表征

3实验结果

3.1壳聚糖纳米粒的制备工艺的考察

3.2洗脱曲线

3.3壳聚糖及其衍生物纳米粒粒径分布及Zeta电位

3.4原子力显微镜观察壳聚糖及其衍生物纳米粒表面形态

4讨论

4.1壳聚糖纳米粒制备方法的考察

4.2壳聚糖的溶解性

4.3壳聚糖及TPP浓度及体积的选择

5小结

参考文献

第四部分壳聚糖及其衍生物纳米粒的脑靶向性评价

第一节载荧光探针的壳聚糖纳米粒的制备与表征

1仪器与材料

2实验方法

3实验结果

4 讨论

5小结

第二节载香豆素-6的壳聚糖及其衍生物纳米粒鼻腔给药的脑靶向评价

1仪器与材料

2实验方法

3.实验结果

4讨论

5小结

参考文献

第五部分载东莨菪碱壳聚糖及其衍生物纳米粒的制备及复方抗晕动药物药代动力学研究

第一节载东莨菪碱壳聚糖及其衍生物纳米粒的制备

1仪器与材料

2实验方法

3实验结果

4小结

第二节载东莨菪碱壳聚糖及其衍生物纳米粒的包封率测定

1仪器与材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

第三节复方抗晕动药物药代动力学研究

1仪器与材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

参考文献

第六部分载东莨菪碱壳聚糖纳米粒的药效学研究

1仪器与材料

1.1仪器

1.2材料与试剂

1.3实验动物

2实验方法

2.1动物分组及给药方案

2.2抗晕动实验

2.3统计分析

3实验结果

4讨论

5小结

第七部分壳聚糖及其衍生物纳米粒鼻腔给药的安全性评价

1仪器与材料

1.1仪器

1.2材料与试剂

1.3实验动物

2实验方法

2.1在体大鼠鼻黏膜模型实验

2.2蟾蜍上颚黏膜模型实验

3实验结果

3.1在体大鼠鼻黏膜模型实验

3.2蟾蜍上颚黏膜模型实验

4讨论

4.2鼻黏膜毒性评价方法

5小结

参考文献

全文总结

综 述壳聚糖及其衍生物作为药物载体研究进展

致 谢