颈椎后纵韧带骨化症差异蛋白验证与功能研究

摘要

目的:后纵韧带骨化症(ossification of posterior longitudinal ligament，OPLL)是临床上常见的脊柱疾患，发病率可高达20％～34％。OPLL的致瘫几率显著高于其他颈椎退变性疾病，其原因包括缺乏有效的早期筛选和诊断方法、自然史不明无法确定手术时机、术后骨化物持续生长等。近年来对其发病机制的研究取得了一些成果，如COL6A1限制性片段多态性与OPLL相关、应力因素是骨化灶进展的重要局部因素等，但其发病机制仍不明确。本研究在前期蛋白组学的研究基础上，对OGN(osteoglycin)以及Ⅵα1胶原蛋白两种差异蛋白在基因水平和蛋白水平进行验证其差异的真实性。并且从无后纵韧带骨化的患者与后纵韧带骨化患者的外周血中分离得到两种差异蛋白mRNA，再利用逆转录技术，实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-Time Quantitive Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)技术验证编码两种蛋白的mRNA存在差异，试图为颈椎后纵韧带骨化症早期诊断及进展寻找血液标志物。采用SiRNA技术对体外培养的后纵韧带骨化韧带细胞进行干扰，继续培养的同时设定未干扰的对照组细胞进行对比，以此来确认OGN在后纵韧带骨化中的作用，沉默OGN基因是否能做到阻断骨化过程。以期寻找OPLL发生、发展过程中特异的蛋白标记物，为临床OPLL筛查和诊断、预后判断、寻找治疗药物靶点、了解OPLL发生发展的分子机制提供研究基础。
　　 方法:以颈椎前路椎体次全切除术中获得的OPLL后纵韧带组织和外伤患者正常后纵韧带组织作为研究对象。在前期蛋白组学研究得出的正常颈椎后纵韧带与后纵韧带骨化症后纵韧带组织间的差异蛋白的基础上，文献回顾总结各差异蛋白的基本信息、分子功能、细胞分布及其参与的生命过程，推测其在OPLL发病机制中的可能作用。对有深入研究价值的差异表达蛋白质OGN以及Ⅵα1胶原蛋白采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术从mRNA水平进一步验证DIGE及质谱结果准确性。同时利用Western-blot技术在蛋白水平验证其差异。抽取颈椎后纵韧带骨化症患者以及无后纵韧带骨化的患者外周血，利用逆转录技术，以及RT-PCR技术验证编码两种蛋白的mRNA之间的差异。采用SiRNA技术对体外培养的后纵韧带骨化韧带细胞进行干扰，继续培养的同时设定未干扰的对照组细胞进行对比，以此来确认OGN在后纵韧带骨化中的作用。
　　 结果:在基因水平验证了正常颈椎后纵韧带组织与后纵韧带骨化症韧带组织中存在差异，编码OGN蛋白的mRNA在颈椎后纵韧带骨化症(cervical ossification ofposterior longitudinal ligament，COPLL)韧带组织中是正常颈椎后纵韧带组织中的3.37倍，差异具有统计学意义；编码Ⅵα1胶原蛋白的COL6A1基因在正常颈椎后纵韧带组织中是COPLL韧带组织中的5.31倍，差异具有统计学意义。在蛋白水平正常颈椎后纵韧带组织与后纵韧带骨化症韧带组织中存在差异，OGN蛋白在COPLL韧带组织中是正常颈椎后纵韧带组织中的5.00倍，差异具有统计学意义。Ⅵα1胶原蛋白正常颈椎后纵韧带组织中是COPLL韧带组织中的5.14，差异具有统计学意义。在外周血中，编码OGN蛋白的mRNA在COPLL患者中高于无后纵韧带骨化患者，COL6A1基因在COPLL患者中低于无后纵韧带骨化患者，但是差异无统计学意义。体外培养颈椎后纵韧带骨化细胞，通过阻断OGN mRNA可以阻断其钙化过程。
　　 结论:在颈椎后纵韧带骨化症患者的后纵韧带组织中，无论是基因水平还是蛋白水平OGN都明显高于正常颈椎后纵韧带组织，而Ⅵα1胶原蛋白都明显低于正常颈椎后纵韧带组织。颈椎后纵韧带骨化症患者外周血中，编码OGN蛋白的mRNA和COL6A1基因无法作为后纵韧带骨化症早期诊断的血液标志物。OGN在颈椎后纵韧带骨化过程中起着重要作用。通过阻断OGN mRNA可以阻断其钙化过程从而阻断钙化过程，可以作为生物治疗颈椎后纵韧带骨化症的目标基因进一步研究开发。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 绪论

第一节后纵韧带骨化症的研究现状

第二节前期研究工作总结

第三节文献回顾筛选差异蛋白

第二章 基因水平差异验证实验

第一节前言

第二节材料与方法

一、样本采集

二、试剂和仪器

三、 RNA提取

四、逆转录(reverse transcription,RT)

五、实时定量PCR

第三节结果

一、 RNA提取

二、 Real time PCR反应结果

三、韧带组织中OGN mRNA和COL6 A1基因PCR电泳

四、相对定量分析

第四节讨论

第三章 蛋白水平差异验证实验

第一节前言

第二节材料与方法

一、样本采集

二、试剂和仪器

三、方法

第三节结果

一、 Western-blot测定Ⅵ α1胶原蛋白表达实验

二、Western-blot测定OGN表达实验

第四节讨论

参考文献

第四章血液中OGNmRNA和COL6A1基因的检测实验

第一节前言

第二节材料与方法

一、样本及采集

二、试剂和仪器

三、 RNA提取

四、逆转录(reverse transcription,RT)

五、实时定量PCR

第三节结果

一、RNA提取

二、 Realtime PCR反应结果

三、血液中OGN mRNA以及COL6A1基因电泳

四、相对定量分析

第四节讨论

参考文献

第五章OGN在颈椎后纵韧带骨化过程中的作用

第一节前言

第二节颈椎后纵韧带骨化韧带细胞的培养

一、材料与方法

二、结果

第三节OGN基因干扰实验

一、材料与器材

二、方法

第四节 结果

第五节 讨论

参考文献

第六章全文总结

颈椎后纵韧带骨化症研究进展

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