大鼠羊膜上皮细胞体外向类神经干细胞诱导分化及其移植后对视神经再生的作用

摘要

视觉系统一些疾病会造成视神经损伤而引起患者失明，目前临床上尚无良好的治疗方法，而视神经再生的研究将为治疗这些疾病提供实验依据。本研究通过体外培养妊娠晚期大鼠羊膜上皮细胞，予以免疫细胞化学、RT-PCR等方法鉴定后，应用不含血清的神经干细胞培养基诱导大鼠羊膜上皮细胞向类神经干细胞方向分化，并予以免疫细胞化学、RT-PCR等方法鉴定。然后，将Hoechst33342荧光标记的正常羊膜上皮细胞与诱导后的羊膜上皮细胞分别移植入大鼠受损视神经中，应用Hoechst33342荧光追踪移植细胞、视网膜HE染色和尼氏染色计数视网膜节细胞数量、视神经HE染色、免疫组织化学染色等方法初步探讨细胞移植后对视网膜节细胞的存活和视神经轴突再生所产生的作用。结果表明，应用不含血清的神经干细胞培养基可诱导大鼠羊膜上皮细胞向类神经干细胞方向分化；诱导前后的羊膜上皮细胞移植入受损视神经后，能在损伤部位大量存活并向损伤区两端迁移，能提高视网膜节细胞存活率，增加远侧段视神经的细胞数量，促进视神经轴突再生。相对来说，诱导后的羊膜上皮细胞较诱导前的细胞移植对视神经修复作用更强些。从而提示我们诱导后的羊膜上皮细胞经移植后能促进视神经损伤的修复，为临床修复视神经提供新思路。
　　 目的：目前视觉系统一些疾病如青光眼、视神经炎、视神经退行性变和外伤等均能造成视神经损伤而引起失明，但目前尚无良好治疗方法，而视神经再生的研究将为治疗这些损伤提供新思路。视神经损伤后形成的抑制性微环境是制约视神经成功再生的主要原因。近年来，人们己从周围神经移植、细胞移植和分子调控三个层面对视神经再生微环境进行调控。本研究从细胞移植的角度，体外培养大鼠羊膜上皮细胞并向类神经干细胞方向诱导后，再移植入大鼠视神经损伤模型中，探讨诱导后羊膜上皮细胞对视神经修复的作用。
　　 方法：(1)取妊娠晚期SD大鼠的羊膜组织，序贯消化后进行羊膜上皮细胞原代培养。(2)应用不含血清的神经干细胞培养基诱导大鼠羊膜上皮细胞向类神经干细胞方向分化。(3)对正常及诱导后细胞进行免疫荧光细胞化学和RT-PCR鉴定。(4)应用Hoechst33342标记诱导前后的羊膜上皮细胞，制作细胞悬液。(5)将诱导前后的羊膜上皮细胞移植入成年雄性SD大鼠视神经吸断伤模型中，设以下4组：正常对照组；损伤组，于眼球后2mm处将微电极玻璃管刺入视神经，完全吸除一段长约0.5mm的神经，致视神经完全断开，但保持视神经外膜和血管完整，于视神经缺损处注入5μl无血清培养基；未诱导细胞组，在损伤组的基础上，于视神经缺损处注入5μl未诱导羊膜上皮细胞悬液(5×106个/ml)；诱导细胞组，在损伤组的基础上，于视神经缺损处注入5μl诱导的羊膜上皮细胞悬液(5×106个/ml)。(6)术后14d经心灌注固定，取眼球视网膜，HE染色观察计数视网膜节细胞的数量。(7)术后28d经心灌注固定，取眼球视网膜铺片，尼氏染色计数视网膜节细胞。(8)术后28d经心灌注固定，制作视神经冰冻切片，观察Hoechst33342标记细胞的存活分布情况。(9)术后14d、28d视神经远侧段HE染色观察组织结构和细胞密度变化。(10)术后14d，免疫组织化学染色SABC法显示各组NF阳性物质在近侧段及远侧段表达情况。(11)术后28 d，免疫组织化学染色SABC法显示各组GAP-43阳性物质在近侧段表达情况。
　　 结果：(1)体外成功培养获得大鼠羊膜上皮细胞，经免疫荧光细胞化学染色鉴定羊膜上皮细胞能表达上皮特异性标志物CK-19、神经类细胞标志物Nestin、GFAP以及细胞多能性标志分子SSEA-4、Vimentin等；RT-PCR鉴定后显示，羊膜上皮细胞能表达外胚层神经类细胞标志物Nestin、GFAP、Tau，中胚层平滑肌细胞标志物SM-22a以及多能性标志物SOX-2、Nanog。(2)应用不含血清的神经干细胞培养基对大鼠羊膜上皮细胞向类神经干细胞方向诱导，免疫荧光细胞化学鉴定显示诱导后的细胞表达上皮特异性标志物CK-19、神经类细胞标志物Nestin、GFAP以及细胞多能性标志分子SSEA-4、Vimentin等；RT-PCR鉴定后显示诱导后的羊膜上皮细胞对外胚层神经类细胞标志物Nestin、GFAP、Tau表达较诱导前的表达增强，而中胚层平滑肌细胞标志物SM-22a以及多能性标志物SOX-2、Nanog表达较诱导前减弱。另外，形态学显示诱导后的细胞突起较诱导前变长，且可融合成网状。(3)术后14 d HE染色计数视网膜节细胞的数量，结果显示损伤组的节细胞密度较其他各组明显降低，细胞移植组的节细胞密度较损伤组明显增加但仍低于正常组，诱导细胞组的节细胞密度高于未诱导细胞组。(4)损伤后28 d，尼氏染色视网膜节细胞的计数结果显示损伤组的节细胞密度较其他各组明显降低，细胞移植组的节细胞密度较损伤组明显增加但仍低于正常组，诱导细胞组的节细胞密度高于未诱导细胞组。(5)将Hoechst33342核标记细胞移植入大鼠视神经吸断伤模型后，伤后28 d取视神经冰冻切片，可观察到损伤区有大量标记的存活细胞，标记细胞能向受损视神经近侧段和远侧段迁移。(6)HE染色视神经显示，损伤区有大量细胞存在，呈不规则条索状分布并向两端延伸。伤后14、28 d计数远侧段细胞结果显示，未诱导细胞组和诱导细胞组的细胞数量较损伤组和正常组明显增多，诱导细胞组的细胞数量多于未诱导细胞组。(7)伤后14 d免疫组织化学法染色后显示损伤组视神经远、近侧段NF表达显著下降，着色较浅，并出现串珠样结构，未诱导细胞组和诱导细胞组的神经远、近侧段的NF阳性物质较损伤组增多，而诱导细胞组的神经远、近侧段的NF阳性物质多于未诱导细胞组，另外近侧段的NF阳性物质多于远侧段。(8)伤后28 d免疫组织化学法染色后显示损伤组视神经GAP-43在近侧段仅有少量表达，细胞移植后近侧段GAP-43表达明显增多，且诱导细胞组较未诱导细胞组多。
　　 结论：(1)体外培养大鼠羊膜上皮细胞，并可诱导其向类神经干细胞分化。(2)诱导前后的细胞移植后，能在损伤的视神经中大量存活、迁移；(3)诱导前后的细胞移植后，能提高视网膜节细胞存活率，促进受损视神经的轴突再生，其中诱导后的羊膜上皮细胞对视神经修复作用更强。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1.前言

2.材料和方法

试剂和设备

2.1羊膜上皮细胞的培养与鉴定

2.2羊膜上皮细胞的诱导分化、培养与鉴定

2.3细胞移植前的制备和标记

2.4视神经损伤模型的制作和分组

2.5视神经冰冻切片

2.6视网膜HE染色节细胞计数

2.7视网膜尼氏染色计数节细胞

2.8视神经石蜡切片和HE染色

2.9 GAP-43免疫组织化学染色

2.10 NF免疫组织化学染色

2.11统计学处理

3.结果

3.1诱导前后的大鼠羊膜上皮细胞的形态及表型特征

3.2移植细胞在受损视神经中的存活和迁移

3.3视网膜HE染色计数节细胞密度

3.4视网膜尼氏染色计数节细胞密度

3.5视神经远侧段的细胞密度

3.6视神经NF的表达

3.7视神经GAP-43的表达

4.讨论

4.1动物模型的可靠性和意义

4.2羊膜上皮细胞向类神经干细胞方向的诱导

4.3诱导前后的羊膜上皮细胞保护视网膜节细胞

4.4诱导前后的羊膜上皮细胞促进视神经再生

参考文献

全文小结

创新点和意义

[文献综述]视神经组织工程重建中基因治疗工具的作用

研究生在读期间发表论文

致谢